美国路阳中国公司为客户提供更理想的光源!
021-64195798
153-17565658
热门关键词:B-100AP LUYOR-3415RG
您的位置:首页>>技术应用>>基因科学

转基因小鼠报告基因选择和小鼠的应用

作者:生命科学事业部时间:2019-12-13 11:19:06浏览118 次

信息摘要:

小鼠由于体形小,易于控制,生长繁殖快,且饲养管理方便,又有明确的质量标准,已培育成大量的近交系、封闭群和基因突变动物。在研发转基因小鼠或基因嵌入报告基因模式小鼠的过程中,经常要用到报告基因。常用的报告基因包括:lacZ、EGFP、zsGreen、EYFP、DsRed (DsRed2)、mRFP、mCherry、HuCD2、Thy1.1、HA tag、FLAG tag、Luciferase等。

转基因小鼠的报告基因如何选择?
在研发转基因小鼠或基因嵌入报告基因模式小鼠的过程中,经常要用到报告基因。常用的报告基因包括:lacZ、EGFP、zsGreen、EYFPDsRed (DsRed2)、mRFP、mCherry、HuCD2、Thy1.1、HA tag、FLAG tag、Luciferase等。那什么时候选择哪种reporter呢?
做小鼠胚胎发育的研究人员一般喜欢用LacZ,也就是将LacZ置于一个启动子的调节之下。用LacZ可以进行胚胎全身染色(whole body staining),这样可以了解一个基因在体内的表达谱全貌。如果做细胞跟踪,比如免疫细胞,神经细胞等,一般喜欢用荧光蛋白。这样一是容易对细胞进行分离(比如FACS)和体外分析,二是容易对分离的细胞进行体内追踪(比如Adoptive transfer)。早些年用的最多的是EGFP和EYFP。有的时候,我们需要将两种不同的reporter小鼠交配在一起,研究两个基因的关系,这时可以将两个基因采用不同的荧光蛋白进行标记,也就是做两种不同的模式小鼠。因为早期大家多是用EGFP,现在可以多做一些其它荧光蛋白的报告基因小鼠,以便跟以前研发的EGFP小鼠结合起来研究。 zsGreen和EGFP, EYFP都是绿色荧光。EGFP和EYFP很难区分开。zsGreen是一个比较稳定的绿色荧光蛋白。DsRed和TdTomato都是红色荧光。这两种荧光蛋白都有报告基因模式小鼠发表。TdTomato是一个信号非常强的荧光蛋白,目前已经有报告基因小鼠发表,对细胞/小鼠也没有明显的毒性。相信以后会有越来越多的小鼠用TdTomato来做报告基因。虽然mRFP和mCherry是两个非常好的荧光蛋白,但由于它们需要584nm的激发光,所以一般的FACS仪器不能检测到信号,需要用到LSRII这样的仪器,而很多实验室可能没有这样的仪器。也有用EBFP, ECFP做细胞实验的,但用到小鼠上的比较少。比如需要用到紫外光来激发。如果想在一个小鼠里表达两种荧光蛋白,更好是用两种分得比较开的,比如,更好不要同时用EGFP和EYFP。
HuCD2和Thy1.1是细胞表面受体。HuCD2因为去掉了C-term序列,使得其失去了信号传导的功能。那什么时候会用这两种分子呢?比如我们想研究一个细胞内蛋白基因(比如转录因子)的功能,经常需要把表达这个蛋白的细胞分离纯化出来。这个时候可以将HuCD2或Thy1.1报告基因放置在这个细胞内蛋白基因启动子下(比如加一个IRES-Thy1.1), 这样所有表达这个细胞内蛋白的细胞都会在细胞表面表达Thy1.1。这样就可以用anti-Thy1.1抗体将这一群细胞分离出来,进行后续研究。当然也可以用anti-Thy1.1抗体进行组织切片的免疫荧光检测。
HA、FLAG、Biotin等是细胞和生化实验中常用的标签多肽或蛋白。在western blot,免疫沉淀(Immunoprecipitation)等实验中经常用到,因为有非常特异的HA、Flag抗体。Biotin可以跟生物素(Streptavidin)直接结合并用于免疫沉淀。在模式小鼠中,这些标签多肽或蛋白可以与要研究的蛋白做成融合蛋白。这种模式小鼠最常被用到的是Chip-chip实验。比如要研究一个转录因子的功能,就需要知道这个转录因子在细胞内(正常或刺激条件下)结合到染色体基因组DNA的位置以及结合序列。我们知道,特异性好、亲和力高的抗转录因子的抗体非常不容易得到或制备。这个时候可以将标签多肽(比如FLAG)放在转录因子的C-term,做成融合蛋白。刺激细胞之后,对细胞进行化学交联,并破碎细胞以及基因组DNA,然后用anti-FLAG抗体作免疫沉淀,将转录因子沉淀下来。最后分析这些转录因子所结合的DNA片段序列,从而找到该转录因子的在基因组上的识别序列,也就找到了该转录因子的作用基因。
荧光素酶做报告基因模式小鼠,一般是为了做活体成像实验。比如在一个细胞因子启动子下面放置荧光素酶基因。免疫小鼠之后,有些细胞或器官表达该细胞因子同时表达荧光素酶。通过注射荧光素酶底物可以检测荧光在小鼠体内的分布,从而得出该细胞因子在不同免疫条件下的表达情况。荧光素酶在癌症研究中也经常用。通过荧光活体成像可以研究肿瘤细胞的发生和转移。报告基因很多。这里只是一点简要的介绍。不同的模式小鼠根据实验目的不同,可以做非常不同的设计。

1481945221819798.jpg

小鼠胚胎移植5个实用方法
小鼠胚胎移植,即通过体外受精或其他方式得到的胚胎移植到假孕受体,使胚胎在体内发育并生崽。由于胚胎移植后能在固定的时间内得到大量的后代,并能提升一定的微生物等级,所以目前该技术在多方面得到运用:生物净化、辅助生殖、快速扩繁等。而今天我就给大家就小鼠胚胎移植方面相关的实验操作,提供一些能让我们的工作变得更加快捷与方便的小技巧;也唠叨一些可以使我们的操作更规范的小“麻烦”。
1、实验后的假孕受体的快速区分:我们进行移植的受体品系一般都是一个品系且体重范围固定,但是胚胎却有多种品系,移植胚胎后的受体从外观上基本无法区分。我们目前推荐的方法是在小鼠耳朵和尾巴上用马克笔直接做标记,标记大概能保持12小时,待移植结束,小鼠苏醒前都不会消失,后面就可以直接上架用笼牌区分即可。该方法的好处就是方便快捷,比打耳标或剪耳更人性化,没有痛苦,减少动物的伤害,让受体能安心怀孕待产,快乐的做鼠妈妈!
2、减少人为的污染:在移植时,使用口吸管操作既可以灵活控制气流,又可高效完成大批量的胚胎操作,所以目前我们选用口吸管来进行胚胎移植,前期我们移植时都是摘下口罩后再用口吸管操作,但是人的口腔是含多种细菌的,很有可能就在你摘下口罩的那一刻把病菌散播到空气当中,污染设施。我们就考虑是否可以通过减少暴露面积,来达到减少污染的目的。后面我们移植采用的都是不摘口罩,口吸管直接从口罩下方进入操作,基本上可以达到口罩挡住口腔,并且不影响移植,这样环境清洁度我们也维持住了,实验也能照常进行,何乐而不为?
3、节省移卵针的使用:我们每天可能会进行多个品系的移植操作,无论是清洗胚胎还是移植胚胎,都要用到移卵针。而为了保证每个品系胚胎不混淆,也保证胚胎微生物等级不互串,我们现在要求一个品系操作完换下一个品系前都需要换针,防止移卵针内有胚胎遗留而造成品系混淆、微生物等级互窜。所以每天我们都需要使用很大数量的移卵针,不停换针也很浪费时间。为此我们想到一个好办法,就是直接在移卵针上提前写好品系编号,这样在操作相应品系时就用该品系编号的针,基本上移卵针就比原来的用量减少了一半,也防止了品系混淆,省心又省力。
4、快速疏通移卵针:移植时,总会遇到一个情况,针头被堵了,胚胎吸不上来,移植也不顺畅,正常情况下我们都会选择换一根针,但是如果是操作不好的新人,估计换了很快又会堵了,就要换N根针了,很浪费!其实有个方法只需要1S就能解决针堵的情况,就是把针头放到打火机的火焰上轻轻一燎,堵住针头的组织就被烧成二氧化碳和水蒸气了,而且还做了一次高温消毒,效果非常好,减少了换针的时间,也减少了浪费,不过燎了也不好使的话还是换针吧!
5、巧修显微镊:移植的显微镊十分娇弱,在不使用的时候我们通常都会用保护套将镊子尖头处护住,但是还是会有不小心将镊子尖头弄弯弄歪的情况,这个时候显微镊基本就不能使用了,因为在显微镜下都是微量操作,稍微弯了或歪了,根本夹不住输卵管或子宫了,这种显微镊基本就被淘汰了。其实这时候我们还是有可能把它挽救回来的,方法就是用持针钳对显微镊的尖头进行微调,并在显微镜下看是否调回可用状态,反复几次,可能就又可以使用了!
其实我想,应该不止是小鼠胚胎移植,大家在实验操作中肯定都会领悟一套自己的小技巧,让自己的工作更轻松,又不违反Sop操作要求,甚至可以更好的维护Sop的要求。而以上就是我们发现的一些小小的方便点,可能算不上特别高大上,也或有不足的地方希望能得到大家指正,当然如果大家觉得真的有用的话就赶紧试试吧!

小鼠在生物基因研究的应用
小鼠由于体形小,易于控制,生长繁殖快,且饲养管理方便,又有明确的质量标准,已培育成大量的近交系、封闭群和基因突变动物。其近交系有500多个,突变系有410多种,远交群有200多种,因此在生物医学研究的各个领域得到广泛应用。现将小鼠在生物医学领域的应用作一简要概述。
(一)药物评价和毒性试验
1.药物急性毒性试验测定  药物或化学制剂的半数致死量及“三致”(致畸、致癌、致突变)试验,小鼠是最合适的动物。
2.生物药品和制剂的效价测定  小鼠广泛用于血清、疫苗等生物制品的检定,如百日咳菌苗、乙肝疫苗等。激素效价的测定,如利用小鼠子宫增重测定人绒毛膜促性腺激素的生物效价。
3.药物筛选试验  小鼠常用于药物对疾病疗效筛选试验,如抗肿瘤药物、抗结核药物、抗疟疾药物等的筛选。
4.用于某些药物药效和副作用的评价  如利用小鼠瞳孔放大作用测试药物对副交感神经的影响;用声源性惊厥的小鼠评价抗痉挛药物;用小鼠热板技术引起的后爪运动或机械压尾评价止痛药的效果;用Termorine羟基衍生物诱发小鼠发抖模型来评价抗颤抖药物的作用(如帕金森病不自觉的颤抖);用小鼠角膜和耳郭反射评价镇静药药效。小鼠还用于全身麻醉药的测试和评价。
(二)肿瘤学研究
肿瘤遗传学的研究进展很快,小鼠已成为研究中的主要材料,用于肿瘤病毒基因组学说和癌基因假说的研究,用于小鼠乳腺癌、垂体肿瘤、肾上腺皮质肿瘤发生过程中基因成分的相互作用的研究。这些小鼠的自发性肿瘤从肿瘤发生学上来看,与人体肿瘤较为接近,用其作为治疗药物的筛选可能更理想。自发性肿瘤多为病毒性,如A系小鼠出生后18个月内有90%的肺癌发生率,C3H小鼠乳腺癌发病率达97%。同时,小鼠对致癌物质敏感,可诱发各种肿瘤,如二乙基亚硝胺可诱发小鼠肺癌、甲基胆蒽可诱发小鼠胃癌和宫颈癌等,是研究人类肿瘤极好的模型。另外,严重免疫缺陷小鼠,如裸鼠、SCID小鼠可接受各种人类肿瘤细胞的植入,直接用于人类肿瘤生长、转移及治疗的研究。
(三)传染性疾病研究
因小鼠对多种病原体敏感,易感染,常用于研究这些病原体的发病机制、临床症状及治疗。常用小鼠对沙门菌病、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、狂犬病、血吸虫病、疟疾、破伤风、脊髓灰质炎和钩端螺旋体病等人和小鼠共患性疾病进行研究,如病原体的致病力、宿主抗病机制、病理过程和治疗学等方面的研究。
(四)遗传学和遗传性疾病的研究
小鼠毛色变化多样,其遗传学基础已研究得比较清楚,因此常用小鼠毛色做遗传学分析。重组近交系用于研究基因定位及其连锁关系。同源近交系用来研究多态性基因位点的多效性、基因的效应和功能以及发现新的等位基因。此外,许多小鼠具有遗传性疾病,如小鼠黑色素病、白化病、系统性红斑狼疮、家族性肥胖、遗传性贫血、尿崩症等。这些疾病与人类发病相似,可用做人类遗传疾病的动物模型。基因工程技术发展,促进了对转基因的动物研究。现在,借助转基因小鼠对基因功能、表达和调节,探索疾病的分子遗传学基础和基因治疗的可能性和方法的研究引起了生物医学界的高度重视。
(五)老年病学的研究
老年学研究的是人类老化现象的起因和机制,期望控制老化,达到延年益寿的目的。小鼠寿命短,传代时间短,随着鼠龄的增加,机体内的一些生理、生化指标不断发生变化,特别是高龄鼠中老年病明显增多,是老年学研究的极好材料。多用于糖质、脂质、胶原和免疫等方面的研究。
(六)计划生育研究
小鼠繁殖力强,性周期和妊娠期短,生长快,适合计划生育研究。如常用小鼠做抗生育、抗着床、抗早孕、抗排卵等实验应用的动物。
(七)免疫学研究
小鼠对特异性抗原的免疫反应受遗传控制。其体内控制免疫反应的基因决定着对各种疾病的易感性,决定着自身免疫病和体液免疫反应。BALB/c、C57BL/6J等小鼠常用于单克隆抗体的制备和研究,免疫缺陷小鼠可用于免疫机制的研究。
(八)微生物学和寄生虫学研究
因小鼠对多种病原体具有易感性,因此通常用它来研究微生物及寄生虫对机体的感染途径、发病机制及综合防治。此外,小鼠还可用于内分泌、呼吸和消化等系统疾病的研究。

 


【转基因小鼠报告基因选择和小鼠的应用】链接地址:https://www.luyoruv.com/new3/482.html
未经公司同意,严禁转载我站文章,经同意转载的,必须注明出处。