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GFP绿色荧光蛋白基因标记的观察方法

作者:生命科学事业部时间:2019-09-22 20:08:54浏览573 次

信息摘要:

GFP吸收的光谱峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副吸收峰(蓝光);发射光谱峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder)。虽然450~490nm只是GFP的副吸收峰,但由于该激发光对细胞的伤害小,因此通常多使用该波段光源(多为488nm)

GFP是什么?

GFP 绿荧光蛋白(Green Fluorescent Portein,GFP)

绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白,当受到紫外或蓝光激发时,发射绿色荧光。其特点在于:它产生荧光无需底物或辅因子,发色团是其蛋白质一级序列固有的来源于水母的氨基酸残基组成。水母的绿色荧光蛋白很稳定,无种属限制,已在多种动植物细胞中表达成功并产生荧光。GFP 的荧光受外界的影响较小,另外GFP 的检测十分方便,而对细胞的伤害小。

绿色荧光蛋白GFP的发光特性:

GFP吸收的光谱峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副吸收峰(蓝光);发射光谱峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder)。虽然450~490nm只是GFP的副吸收峰,但由于该激发光对细胞的伤害小,因此通常多使用该波段光源(多为488nm)。此外,GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,两者通常共有一套滤光片。GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素强,特别是在450~490nm蓝光波长下稳定。类似的,GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此适用于定量测定与分析。由于GFP荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白,比如萤火虫荧光素酶等。

绿色荧光蛋白在大肠杆菌的表达

绿色荧光蛋白GFP的常规观察方法:

1.荧光显微镜

 荧光显微镜(Fluorescence microscope) : 荧光显微镜是以紫外线为光源, 用以照射被检物体,使之发出荧光,然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。 细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫外线照射后可发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射亦可发荧光,荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。目前在常用的方法就是采用荧光显微镜观察,荧光显微镜在实验室普及,但不足的是必须采集叶片或动物切片进行观察,对培养的标本进行破坏,无法进行活体观察。

荧光显微镜

2. 紫外光源

采用紫外光源LUYOR-3260UV(又叫紫外线灯、黑光灯 uv lamp,uv light)观察也非常方便,但如果观察植物,植物叶片的叶绿色在紫外线灯下也会发出荧光,对gfp发出的荧光也会产生干扰,另外,标本长时间在紫外光源照射下对GFP标本组织也会造成破坏。

绿色荧光蛋白的激发波长的光谱图

3.便携式GFP激发光源

采用便携式GFP激发光源LUYOR-3415(又叫荧光蛋白观测镜)是便捷、方便的观察方法,因GFP在470nm有一个很高的吸收峰,采用 470nm激发光源能够激发GFP发出明亮的绿色荧光,在观察gfp荧光时,因为激发光为强烈的蓝色光线,佩戴专业的观察眼镜才能观察到清晰的荧光信号。推荐使用美国路阳LUYOR-3260便携式激发光源。因此,使用便携式GFP激发光源为方便有效的观察办法。

荧光蛋白激发光源LUYOR-3415的主要产品应用:

检测转绿色荧光蛋白(GFP)基因、红色荧光蛋白DsRed)基因植物:水稻、小麦、玉米、大豆、棉花、拟南芥

检测转GFP、DsRed基因动物:小鼠、兔子、猴子等;

检测转GFP、DsRed基因微生物:细菌、真菌、酵母等;

检测GFP、DsRed基因组织特异性表达;



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