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GFP的激发光波长和GFP的发射光波长

作者:激发光源事业部时间:2019-12-17 11:23:20浏览6338 次

信息摘要:

GFP绿色荧光蛋白在分子和细胞生物学中的应用越来越多。由于应用的多样性,已经开发出形成原始野生型绿色荧光蛋白(wtGFP)的几种变体。这些变体中的几个具有与wtGFP不同的激发和发射光谱。

GFP的激发光波长和GFP的发射光波长因GFP的种类不一样,会有差别。

GFP绿色荧光蛋白在分子和细胞生物学中的应用越来越多。由于应用的多样性,已经开发出形成原始野生型绿色荧光蛋白(wtGFP)的几种变体。这些变体中的几个具有与wtGFP不同的激发和发射光谱。

wtGFP绿色荧光蛋白最常用的突变可分为三类:

(1)红移变体;
(2)像变体一样的野生型;
(3)蓝色发射变体。

如图1所示,以EGFP为代表的红移变体具有一个集中在约488 nm处的单个激发峰,发射峰波长为509 nm。类似野生型的变体的主要激发峰位于395 nm,发射峰位于509 nm,而发出蓝色的突变体通常在380 nm附近有一个激发峰,在460 nm附近有一个发射峰(图1)。img2.gif

 

表1.GFP变体的激发和发射数据

GFP Variant Excitation max (nm) Emission max (nm)
wtGFP 395 509
GFPuV 395 509
Stemmer 395 509
EGFP 488 509
GFP-S65T 489 509
Y66H 382 459
EBFP 380 460

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GFP的激发光

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LUYOR-3415RG便携式荧光蛋白激发光源

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绿色荧光蛋白在斑马鱼上的表达

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红色荧光蛋白在斑马鱼上的表达

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绿色荧光蛋白在果蝇上的表达

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绿色荧光蛋白在老鼠幼崽上的表达

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红色荧光蛋白拟南芥上的表达

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绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白GFP的发现

绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein,简称GFP)是在美国西北海岸所盛产的一种名为Aequorea victoria的水母中发现的一种可以发出绿色荧光的蛋白质。GFP最早是在1962年由日本科学家下村修发现,是由238氨基酸组成的单体蛋白质,蛋白分子量约为27kD。GFP的晶体结构显示,蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构,长420nm,宽240nm,由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成,桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖,底部由一个短的垂直片段覆盖,对荧光活性很重要的生色团则位于桶的大空腔内。实验表明GFP荧光产生的前提是桶状结构完整性,去除N端6个氨基酸或C端9个氨基酸,GFP均会失去荧光。原因是GFP生色团的形成效率较低,而且形成过程受外界环境影响较大。

绿色荧光蛋白GFP的应用

  • 绿色荧光蛋白GFP在分子生物学上的应用

    • 绿色荧光蛋白GFP作为报告基因

    • 绿色荧光蛋白GFP作为融合标签

  • 作为生物传感器

    • 检测pH

    • 检测卤素离子

  • 绿色荧光蛋白GFP在细胞生物学上的应用

    • 绿色荧光蛋白GFP用于细胞的筛选

    • 绿色荧光蛋白GFP用于药物的筛选

绿色荧光蛋白GFP的发光原理

GFP的第65至67位的三个氨基酸(丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。当蛋白质链折叠时,这段被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段,得以“亲密接触”,导致经环化形成咪唑酮,并发生脱水反应。在分子氧存在的条件下,发色团可进一步发生氧化脱氢,最终成熟,形成可发射荧光的形式。具体过程为:在 O2存在下,GFP分子内第67位甘氨酸的酰胺对第65位丝氨酸的羧基进行亲核攻击,形成第5位碳原子咪唑基;第66位酪氨酸的α2β键脱氢反应之后,导致芳香团与咪唑基结合,并最终自发催化形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色。

GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复。一般来说弱还原剂并不会影响GFP荧光,中度氧化剂如生物材料的固定,脱水剂戊二酸或甲醛等对GFP荧光影响也不大。

绿色荧光蛋白GFP的发光特性

GFP吸收的光谱更大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副吸收峰(蓝光);发射光谱更大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder)。虽然450~490nm只是GFP的副吸收峰,但由于该激发光对细胞的伤害更小,因此通常多使用该波段光源(多为488nm)。此外,GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,两者通常共有一套滤光片。GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素强,特别是在450~490nm蓝光波长下更稳定。类似的,GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。由于GFP荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白,比如萤火虫荧光素酶等。

绿色荧光蛋白序列信息

绿色荧光蛋白GFP序列信息

相关GFP的变体

在GFP发现的半个世纪中,陆续衍生了多个变体,其中最的要属其红移变体——增强型绿色荧光蛋白(enhanced GFP,EGFP;EGFP的更大吸收峰位于488nm)。其他还包括发射荧光也发生改变的变体,包括蓝色荧光蛋白:EBFP,EBFP2,Azurite,mKalama;青色荧光蛋白:ECFP,Cerulean,CyPet;黄色荧光蛋白YFPCitrineVenus,YPet等等。


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