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荧光显微镜为何要选择不同滤色片?

作者:激发光源事业部时间:2019-12-04 07:42:07浏览453 次

信息摘要:

带通滤光片通常通过中间波长和区间宽度确定。在较为简单的荧光显微镜装置中,一旦激发光线离开激发滤光片,即会照射到靶标上,靶标上的荧光基团随即变为激发状态,然后发射向光谱的红外端迁移的光线。

显微镜的放大率和分辨率之间的区别
了解荧光成像时要获得良好结果时,了解放大倍率和分辨率之间的区别非常重要。当谈论放大倍数时,我们指的是在显微镜下观察物体时会出现多大的物体。相反,当我们从实际意义上谈论分辨率时,我们指的是我们可以在图像中区分多少细节,这可能是主观的。从技术上讲,分辨率受光的折射特性限制。

使用荧光可以提高分辨率
分辨率和放大率不一样。在显微镜下,我们将放大图像中可见的细节称为分辨率。如果您看不到放大后的样本中的细节,则放大或使某些内容看起来变大不会有什么好处。明视野显微镜依赖于由于样品各个部分之间的密度差异而导致的光吸收差异,就我们的目的而言,这就是细胞。因此,当您想在细胞中看到许多细节时,明场显微镜并不是很好。您如何提高分辨率?加入荧光团以染色样品中的结构,并过滤以照亮样品,聚焦样品发出的光,添加灵敏的检测器,瞧!现在您可以进行荧光显微镜检查了。荧光显微镜通过使细胞中的各种结构形成对比,为您提供了更好的分辨率的优势 与他们的邻居更好,并且允许您收集一种以上颜色的图像。


荧光显微镜基本结构:
大部分荧光成像通过荧光显微镜完成,其包括以下基本元件:
•光源: 通常是氙弧灯或汞灯,但近年来也使用高功率LED
滤光片(入射光): 将入射光波长缩减到只留下用于激发样品的波长,有趣的是,其被称为激发滤光片
•二向分色镜或反射镜:  将激发光反射到样品上,并同时只通过来自样品的发射光,传递到检测仪(如下图)

•滤光片(发射光): 只能通过来自样品的发射光波长,并阻挡所有通过激发滤光片的光线,如您所想,其被称为发射滤光片
•CCD照相机: 发射光如果不能检测到,则没有任何用处;对于荧光成像来说,检测仪通常是CCD照相机,这种照相机一般也连接到电脑屏幕,能够为您呈现图像。

荧光显微镜中的光路
照射和发射光通过同个物镜的设计被称为落射荧光显微镜(epifluorescence microscopy),词中的“epi”借用自希腊语,意为“相同”,更加准确的说法应是落射荧光照明,但是因为荧光依赖于照明,所以人们默认省略了照明部分。透射照明荧光显微镜不常见,但是您也可能遇到放置样品的载物台在中间,照射和信号收集在其两侧的设置方法。

放大倍数与分辨率
放大倍数:为了在荧光成像中获得良好结果,理解放大倍数和分辨率的区别很重要。当提到放大倍数,指的是当我们在显微镜下观察一个对象时,它比原本放大了多少(图4)。
分辨率:与此相反,实际意义上的分辨率指的是图片中我们能够分辨多少细节,这可能是主观的。从技术层面更深入地讲,分辨率受到光的折射特性的限制。

荧光显微镜的极限分辨率
它指典型的落射荧光照明复合显微镜无法分辨或区分距离小于200 nm的两个物体。此外,因为整个样品被同时照射,所以样品中所有聚焦和离焦的光线都被检测到。这些限制意味着,根据物镜中的镜片,您可能能够确定一个细胞中的两个不同颜色的探针,但是如果没有很多对照、单像素分析和计算,就无法分辨它们之间的空间关系。此外,因为您没有掌握任何深度相关信息,所以无法从落射荧光显微镜拍摄的图片中得到关于体积的可靠结论。通过了解系统的限制,您能够对获得的数据和图像更加确信,也能够完全理解您的数据并明确表达结论。
 激光扫描共聚焦显微镜也依赖于复合光显微镜设置,但能够获得更高的分辨率。其分辨率的提高源于使用激光作为照明,其将激发光范围缩窄到~2-3nm。这比使用激发滤光片组准确十倍。此外,一次实验中只从一个焦平面获得图像,使用针孔阻挡离焦光线到达检测仪,可以去除所有分散和离焦光线,从而提高了分辨率对单个焦平面的限制,这被称为选择性分区。这种针孔只允许来自样品很窄区间的光线通过,所以能够改善深度方面的信息。这比使用落射荧光获得的分辨率有所提高,落射荧光收集一个细胞中很多焦平面的光线。科研人员也可以通过其他选择获得更高的分辨率,但是这些方法更加专业化,并需要更多的技术知识才能着手。

正置和倒置显微镜
有时候听到人们称显微镜为正置或者倒置,这些术语指的是一些元件的位置,如物镜和光源。正置显微镜的物镜在放置样品的载物台之上;倒置显微镜的物镜在放置样品的载物台之下。正置和倒置显微镜产生和引导光线通过不同路径的能力并没有根本不同。其实您所能获得的图像质量与样品制备、镜片、光源和波长、染料滤光片组设置以及照相机等更加相关,而非显微镜元件的位置。一些实验需要特定方向才能获得所需的结果,所以观察一台没用过的显微镜并全面考虑实验步骤以确定其设置符合您的实验需要,这始终是一种明智的做法。

滤光片可帮助您在成像时控制光线
将滤光片组放在荧光显微镜的不同光点上,即可设定激发样品的光线波长,以及在荧光发射时检测到的波长。

DAPI染料的激发光和发射光的滤光片

荧光成像使用的滤光片的不同类型
通常情况下,滤光片组被设计成可用于捕获指定荧光团的更大激发和发射波长,但不会捕获所有的荧光。多数现代化滤光片组的设计旨在确保激发滤光片只允许指定波长区间的光线通过。这种类型的滤光片称为带通滤光片(band-pass filter)。带通滤光片通常通过中间波长和区间宽度确定。在较为简单的荧光显微镜装置中,一旦激发光线离开激发滤光片,即会照射到靶标上,靶标上的荧光基团随即变为激发状态,然后发射向光谱的红外端(相对于激发光线)迁移的光线。并非所有此类发射光线都会被检测器捕获到——仅那些允许通过二向分色镜且能通过发射滤光片的光线。发射滤光片通常为带通滤光片或长通滤光片,具体取决于特定的荧光团和成像实验。如果您希望让超过特定波长的光线通过检测器,可选择长通滤光片.

 文章内容摘自:赛默飞公司产品资料


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