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荧光蛋白常见问答

作者:激发光源事业部时间:2019-11-29 10:52:52浏览329 次

信息摘要:

荧光蛋白(Green fluorescent protein,简称GFP),是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质,从蓝光到紫外线都能使其激发,发出绿色萤光。虽然许多其他海洋生物也有类似的绿色荧光蛋白,但传统上,绿色荧光蛋白(GFP)指首先从维多利亚多管发光水母中分离的蛋白质。这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在维多利亚多管发光水母中发现。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质水母素的帮助,且这个冷光蛋白质与钙离子可产生交互作用。

绿色荧光蛋白GFP)的基因序列有多大 ?

最开始是 238 个氨基酸的肽链,约 25KDa。然后按一定规则,11 条β-折叠在外周围成圆柱状的栅栏;圆柱中,α-螺旋把发色团固定在正几乎中心处。发色图被围在中心,能避免偶极化的水分子、顺磁化的氧分子或者顺反异构作用与发色团,致使荧光猝灭。

什么是绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白分子的形状呈圆柱形,就像一个桶,负责发光的基团位于桶中央,因此,绿色荧光蛋白可形象地比喻成一个装有色素的“油漆桶”。装在“桶”中的发光基团对蓝色光照特别敏感。当它受到蓝光照射时,会吸收蓝光的部分能量,然后发射出绿色的荧光。利用这一性质,生物学家们可以用绿色荧光蛋白来标记几乎任何生物分子或细胞,然后在蓝光照射下进行显微镜观察。原本黑暗或透明的视场马上变得星光点点——那是被标记了的活动目标。对生物活体样本的实时观察,在绿色荧光蛋白被发现和应用以前,是根本不可想象的。而这种彻底改变了生物学研究的蛋白质,最初是从一种广泛生活于太平洋海域的发光水母体内分离得到的。

绿色荧光蛋白在细胞生物学中有哪些应用 ?

绿色荧光蛋的发光机理比荧光素/荧光素酶要简单得多。一种荧光素酶只能与相对应的一种荧光素合作来发光,而绿色荧光蛋白并不需要与其他物质合作,只需要用蓝光照射,就能自己发光。在生物学研究中,科学家们常常利用这种能自己发光的荧光分子来作为生物体的标记。将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上,原来不可见的部分就变得可见了。生物学家一直利用这种标记方法,把原本透明的细胞或细胞器从黑暗的显微镜视场中“揪出来”。传统的荧光分子在发光的同时,会产生具有毒性的氧自由基,导致被观察的细胞死亡,这叫做“光毒性”,因此,在绿色荧光蛋白发现以前,科学家们只能通过荧光标记来研究死亡细胞静态结构,而绿色荧光蛋白的光毒性非常弱,非常适合用于标记活细胞。有了这些荧光蛋白,科学家们就好像在细胞内装上了“摄像头”,得以实时监测各种病毒“为非作歹”的过程。通过沙尔菲的基因克隆思路,科学家们还培育出了荧光老鼠和荧光猪,由于沙尔菲与钱永健的突出贡献,他们与绿色荧光蛋白的发现者下村修共享了2008年的诺贝尔化学奖。

荧光蛋白在动植物体内的表达

绿色荧光蛋白标记技术有什么意义?

美籍华人钱永健系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理,并对它进行了大刀阔斧的化学改造,不但大大增强了它的发光效率,还发展出了红色、蓝色、黄色荧光蛋白,使得荧光蛋白真正成为了一个琳琅满目的工具箱,供生物学家们选用。目前生物实验室普遍使用的荧光蛋白,大部分是钱永健改造的变种。有了这些荧光蛋白,科学家们就好像在细胞内装上了“摄像头”,得以实时监测各种病毒“为非作歹”的过程。通过沙尔菲的基因克隆思路,科学家们还培育出了荧光老鼠和荧光猪,由于沙尔菲与钱永健的突出贡献,他们与绿色荧光蛋白的发现者下村修共享了今年的诺贝尔化学奖。

荧光素酶报告基因与绿色荧光蛋白(GFP)有什么区别 ?

1.两者的结果检测方法不同.GFP绿色荧光蛋白,很直观,能够直接检到荧光,在普通的细胞培养条件下都能够观察到,对细胞的生命活动和其他并行的实验安排影响很小.荧光素酶报告基因使用起来比GFP多一个步骤,因为荧光素酶是个酶,不发荧光,发荧光的是它的底物,荧光素.荧光素在细胞里(要说萤火虫细胞我就不知道了哦)是没有的.所以检测荧光素酶的通常步骤是裂解细胞,释放荧光素酶,与荧光素及其他所需化学物质混合,才得到荧光.现在虽然也有活细胞内检测荧光素酶的手段,但要将荧光素送入活细胞,本身就已要对细胞进行相当的干扰.所以一般来说荧光素酶实验的同一批细胞不适合再做其他并行实验.
2.两者的结果含义不同.GFP如果说是定量检测表达蛋白的话,这个定量只能够指,表达的细胞是多少个,不表达的细胞是多少个.GFP对于单个细胞来说,就有阳性和阴性两种结果罢了.GFP不能够定量地告诉你,这个/群细胞里的表达量是多高还是多低.荧光素酶就能够定量地得到表达量/表达水平的数值,但这个数值是相对于一群细胞来说,而不是对于单个细胞.所以荧光素酶常常用来研究启动子的功能与调控,因为启动子对基因表达的调控可以是渐变的,而不是简单的开和关两种状态.

荧光蛋白能够发光的原因?

从水母体内发现的GFP是由238个氨基酸构成,第65、66、67位氨基酸(SerTyrGly)形成发光团,经共价键连接而形成对羟苯甲基咪唑烷酮,可被光激发产生荧光[3-4]。许多科学家利用荧光蛋白的发光机理,将水母中荧光蛋白基因提取出来,转入其他生物体内,使得生物变幻的多姿多彩。 一般的荧光染料标记的微生物,由于其生长快、分裂多,染料可在短时间内被稀释,所以不能实时准确地观察微生物侵入活体动物以及细胞的过程。近年发现,荧光蛋白可用于示踪流行性病毒对活体细胞的感染,流行性病毒可被实时监控,借助于这一新技术,我们可以更深入地研究其感染方式。Zhao等发现用GFP标记细菌,可以详细地对细菌的入侵进行时空检测,以确定细菌特异性的感染部位以及传染源的空间位移。GFP克服了一般荧光染料所带有的缺陷,GFP必将会进一步地取代一般的荧光染料,有效地帮助学术研究者观察分析细菌、病毒的感染方式。

绿色荧光蛋白(EGFP)由荧光显微镜蓝光激发,红色荧光蛋白monomeric red fluorescent protein (mRFP)是什么光激发的?
红色荧光蛋白monomeric red fluorescent protein (mRFP)是用530nm绿光激发。

荧光显微镜最常用的激发有哪几种?
紫外激发蓝色荧光 如DAPI染料,蓝光激发绿色荧光 如FITC染料,绿光激发红色荧光 如罗丹明染料。

fitc绿色荧光的激发波长是多少 ?
荧光素FITC的激发波长为495nm,发射波长为519nm,一般选用波长为488nm的激光器来激发这种荧光素,FITC分子量为389.4,吸收光波长为490~495nm,发射光波长为520~530nm


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