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植物学硕士与GFP的爱恨情仇

作者:生命科学事业部时间:2019-12-02 08:33:29浏览339 次

信息摘要:

一个植物学硕士生和GFP的爱恨情仇

依稀记得那是一个阳光明媚的午后,导师把我叫到幽暗的办公室,脸上带着谜一般的微笑看着我。那一瞬间我的瞳孔放大,内心忐忑,当下只想导师看不见我,然后以光速转身离开至导师的视线范围外。可现实是真的残酷啊!常话说得好,事出反常必有妖(苦笑ing)。“最近实验做的怎么样呀?基本实验技能都掌握的不差了吧!”“挺……挺好的,该学的都学了……”“我有一个想法,你看我们给xx蛋白融合GFP后是不是就可以追踪它在植物活体内的转移情况了?”从此,我与GFP演绎了一场的爱恨情仇狗血剧。
“师兄,你有没有构建过带GFP标签的基因表达载体啊?”“Of course!GFP这么小,很容易装进去的,你只需要如此……再这样……” “但我的目的基因有9k。”“打扰了,告辞。”嘴上说着不要,身体却很诚实。最终,尝尽各种方法,历时整整半年,我成功将融合GFP的目的基因通过多片段重组装入表达载体。我本属于这个世界,在那一刻,我觉得全世界都属于我(哈哈哈~哈哈~哈~~~)。
可好景不长,我的宇宙神话泡泡仅坚持了100h就被无情戳破了。我发现叶片上注射农杆菌的部位确实能观测到GFP荧光,但无法成功实现对蛋白的转移追踪,植株非注射叶片中呈现给我的只有一片黑暗,正如我的心情一样(送上一首凉凉给自己),当场自闭。随后,导师在听完我汇报后意味深长地说:“你有没有看过文献,别人将GFP融合在xx同源蛋白的N端还是C端,或者其他位置呢?GFP的融合位置对蛋白的表达和转移可能有影响。”从此以后,我明白了实验前大量阅读相关文献以及与导师沟通的必要性(一脸认真)。
历史性的一刻终于到来啦!我在植株非注射叶片上观测到蛋白转移后的GFP荧光了。

GFP在显微镜下的荧光

 
“你以为这样就结束了吗?”导师再次意味深长地的看着我。“你要拍怎样的照片去证明你蛋白的转移呢?”说完给了我一个高深莫测的背影缓缓离去。留下一头雾水的我,我当下拍上了日渐掉发的脑门儿,意识到荧光显微镜的图像无法直观体现出对GFP标签蛋白转移的追踪。我又默默地转过头看着取样后破破烂烂的植株,泪,再次流了下来(em……是咸的)……
事后我又从文献中了解到利用高强度紫外光源照射植株体即可激发GFP荧光,且可以在对样本零破坏的情况下实现对植株活体全局的荧光观测,直观追踪荧光蛋白表达。而正巧本实验室就有这么一台高强度紫外光源。“当上帝关了这扇门,一定会为你打开另一扇门”《圣经》诚不欺我。然而,上帝可能因为网络延迟问题没能及时收到我的求助,紫外灯下我的植株只能看到叶片上的点点繁星(其实是灰尘),我的绿色荧光呐!

紫外线灯下的烟草 
百般无奈之下,只好拿出我玩英雄联盟的专注度,历经一整夜在x度,xx通,xx虫上的奋战后,感谢上帝给我安排的天使终于到来啦!她耐心的为我解答了我的所有疑惑。知悉天然GFP有多个吸收峰,更大和次大的激发波长分别是395nm和475nm,紫外光和蓝光均可激发荧光。而我构建载体所用为增强型绿色荧光蛋白(eGFP),即GFP的第64位的苯丙氨酸置换成亮氨酸,第65位的丝氨酸置换成苏氨酸。EGFP在488nm的蓝光激发下产生波长为517nm的绿色发射光,其荧光强度是同条件下GFP的35倍多,但紫外光源无法激发荧光。恍然大悟的我啪的一下,历尽千辛万苦终于向上帝要来了天使小姐姐微信二维码,为荧光蛋白发愁的小伙伴们我只能帮你们到这里咯!


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烟草的GFP在LUYOR-3415RG照射下发出绿色荧光

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