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绿色荧光蛋白GFP

作者:激发光源事业部时间:2019-12-20 10:31:28浏览166 次

信息摘要:

绿色荧光蛋白GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复。一般来说弱还原剂并不会影响GFP荧光,中度氧化剂如生物材料的固定,脱水剂戊二酸或甲醛等对GFP荧光影响也不大。

绿色荧光蛋白GFP

绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein,简称GFP)是在美国西北海岸所盛产的一种名为Aequorea victoria的水母中发现的一种可以发出绿色荧光的蛋白质。GFP最早是在1962年由日本科学家下村修发现,是由238氨基酸组成的单体蛋白质,蛋白分子量约为27kD。GFP的晶体结构显示,蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构,长420nm,宽240nm,由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成,桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖,底部由一个短的垂直片段覆盖,对荧光活性很重要的生色团则位于桶的大空腔内。实验表明GFP荧光产生的前提是桶状结构完整性,去除N端6个氨基酸或C端9个氨基酸,GFP均会失去荧光。原因是GFP生色团的形成效率较低,而且形成过程受外界环境影响较大。

绿色荧光蛋白发光原理:

绿色荧光蛋白GFP的第65至67位的三个氨基酸(丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。当蛋白质链折叠时,这段被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段,得以“亲密接触”,导致经环化形成咪唑酮,并发生脱水反应。在分子氧存在的条件下,发色团可进一步发生氧化脱氢,最终成熟,形成可发射荧光的形式。具体过程为:在 O2存在下,GFP分子内第67位甘氨酸的酰胺对第65位丝氨酸的羧基进行亲核攻击,形成第5位碳原子咪唑基;第66位酪氨酸的α2β键脱氢反应之后,导致芳香团与咪唑基结合,并最终自发催化形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色。

绿色荧光蛋白GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复。一般来说弱还原剂并不会影响GFP荧光,中度氧化剂如生物材料的固定,脱水剂戊二酸或甲醛等对GFP荧光影响也不大。

绿色荧光蛋白GFP的结构

绿色荧光蛋白发光特性:

GFP吸收的光谱更大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副吸收峰(蓝光);发射光谱更大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder)。虽然450~490nm只是GFP的副吸收峰,但由于该激发光对细胞的伤害更小,因此通常多使用该波段光源(多为488nm)。此外,GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,两者通常共有一套滤光片。GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素强,特别是在450~490nm蓝光波长下更稳定。类似的,GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。由于GFP荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白,比如萤火虫荧光素酶等。

绿色荧光蛋白的应用:

广泛应用于分子标记,体内示踪,信号转导,药物筛选等生物科研的各个方面。


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