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为什么在紫外光照射下绿色荧光蛋白能发光?

作者:紫外光源事业部时间:2019-09-05 10:27:51浏览524 次

信息摘要:

 GFP吸收的光谱更大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副吸收峰(蓝光);发射光谱更大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder)。虽然450~490nm只是GFP的副吸收峰,但由于该激发光对细胞的伤害更小,因此通常多使用该波段光源(多为488nm)。

GFP的中心是由三个氨基酸经自催化形成的一个共轭体系。事实上很多分子都具有荧光性质,但是大共轭体系的能级更细,而且吸收和发光谱段都在可见光区,再加上GFP优良的生物合成性质,所以被广泛用于活体生物检测。不过在活体生物检测中使用化学合成的荧光分子作标记也是很常见的,其不依赖于生物合成,有更高的可控性,当然成本也更高。
在蛋白质分子中, 能发射荧光的氨基酸有色氨酸(Trp )、酪氨酸(T yr) 以及苯丙氨酸(Phe)三种。个别蛋白质分子含有的黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD ) 也能发射荧光。Trp、Tyr 以及 Phe 由于其侧链生色基团的不同而有不同的荧光激发和发射光谱。其中 Trp 的荧光强度更大, Tyr 次之, Phe 最小。

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三种氨基酸都都属于芳香类氨基酸。发出荧光通常在 280 nm 或更长的波长被激发,如果想选择性的激发色氨酸,要选择295 nm的波长。 Phe 在 绝大多数实验条件下不被激发, 所以很少能观察到 Phe 的发射。因此,蛋白质的内源荧光主要来自 Trp 和 Tyr 残基。Trp 残基对微环境的变化很敏感, 并且大多数蛋白质都含有几个不同的 Trp 残基, 因而常作为内源荧光探针来研究溶液状态下蛋白质的构象。


色氨酸发出的荧光是如何根据微环境变化而变化的呢? 这个问题很有趣。当蛋白质处于折叠状态时,如果在蛋白质内部含有色氨酸,色氨酸周围的环境主要是疏水的,此时色氨酸发出的荧光的强度会很高,同时发出荧光的更大光强度在波长330 nm处。当蛋白质处在解折叠状态时,色氨酸完全暴露在溶液中,周围环境是亲水的,此时色氨酸发出荧光的强度会变低,同时发出荧光的更大光强度的波长会增大,移动到350 nm处


荧光蛋白发光特性

GFP吸收的光谱更大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副吸收峰(蓝光);发射光谱更大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder)。虽然450~490nm只是GFP的副吸收峰,但由于该激发光对细胞的伤害更小,因此通常多使用该波段光源(多为488nm)。


GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素强,特别是在450~490nm蓝光波长下更稳定。类似的,GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。由于GFP荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白,比如荧光蛋白的应用非常的广泛(如上图), 已经应用于分子标记,体内示踪,信号转导,药物筛选等生物科研的各个方面荧光让我们能够检测分子的构象变化,也能让我们追踪化学反应.... 是科学研究的重要手段之一。与荧光相似,生物发光也常用在实验室中。与荧光不同,生物发光不需要激发光照射。

 

 


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