美国路阳中国公司为客户提供更理想的光源!
021-64195798
153-17565658
热门关键词:B-100AP LUYOR-3415RG
您的位置:首页>>技术应用>>基因科学

转基因动物的基因导入和检测

作者:时间:2019-12-01 15:26:36浏览247 次

信息摘要:

将外源性基因用实验方法插入动物生殖细胞的基因组而获得具有插入基因特性,并能正常繁衍的动物称为转基因动物 ( transgenicanimals)。转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。同时人类遗传病的转基因动物模型的建立,为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。

转基因动物
将外源性基因用实验方法插入动物生殖细胞的基因组而获得具有插入基因特性,并能正常繁衍的动物称为转基因动物 ( transgenicanimals)。转基因技术是生物学领域最新重大进展之一,已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。同时人类遗传病的转基因动物模型的建立,为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。
转基因技术涉及外源基因的组建、载体、受体、基因导入技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等方面的内容。

一、转移基因
(一)转移基因的原理:转基因技术的理论基础在于各种生物的遗传密码都是统一的。都是以3个碱基决定一个氨基酸这样的密码形式贮存在DNA链上,各物种间形状的不同仅仅是由于DNA上的四种核苷酸排列次序的不同,同时各种生物从DNA到蛋白质合成都服从“中心法则”,当一个物种的细胞内加入另一物种或人工合成的DNA(即基因)后就可能产生新的性状。
(二)基因的获得:取自现有的生物体如病毒、细菌、体细胞或肿瘤细胞的DNA,用限制内切酶或外切酶把DNA切割成若干小段,然后再把这些小段利用连接酶分别放入载体中,并建成载体克隆。载体通常是一种独立的,能自我复制的遗传物质,如质粒、某些噬菌体和病毒均可作为载体。基因的片断可随载体复制,有时亦可表达,用DNA 或抗体探针做分子杂交试验或ELISA试验筛选出带有理想基因的克隆,再把理想基因载体放入大肠杆菌等宿主细胞中扩大、增殖,或采用PCR的方法扩增。再对扩增的DNA片断进行适当修饰,例如将一个单一的基因与经选择的启动子重组合,然后进行转移,或将特定的控制序列连接到目的基因的结构序列上,从而创造1个新的重组基因,然后再进行转移。
理想基因也可用人工合成的办法获得,要合成一特定的基因,就是要合成具有一定排列顺序的DNA,DNA上四种碱基的配对是非常严格的,腺嘌呤(A)必定和胸腺嘧啶(T) 配对,鸟嘌呤(G)必定和胞嘧啶(C)配对,由于蛋白质合成不是直接以DNA作为模板,而是以DNA的副本mRNA作为模板,在RNA中,用尿嘧啶(U)代替了胸腺嘧啶(T)。

转基因老鼠

二、基因转移的受体细胞
研究转基因动物的制备,首先要考虑用何种转基因受体细胞。选择合适的受体细胞和可行的基因导入途径,是该技术成功的前提。基因转移的受体细胞必须是全能细胞,全能细胞随着细胞分化、胚胎发育,可以把其中的基因组贮存的全部遗传信息扩大到生物体所有的细胞中。除此以外至少是多能细胞。满足转基因动物需要的受体细胞有以下几种。
(一)原生殖细胞:禽类的原生殖细胞容易分离、培养和冷冻,所以,这种受体细胞在禽类动物较易实现。
(二)配子:配子能把自身携带的基因组全部信息和外源插入基因序列,完整地贡献给合子。由于精子可用作有效的转移载体,所以,可以精子作为目的基因的受体。较多的是用重组病毒直接感染精子,精子即可把外源基因传到合子。
(三)受精卵或胚胎内细胞团:精卵结合形成的单细胞受精卵,是最常用的外源基因转移的受体;受精后的早期胚胎及囊胚期稍后的胚胎含有的内细胞团,该细胞团内含有未分化的胚胎干细胞,也可认为是全能的,或至少是多能性的,所以,用该时期的内细胞团或囊胚期的细胞作为外源基因的受体细胞,也可望达到基因转移的目的。但这种情况下制备的转基因动物多为嵌合体。

三、实验动物的准备
本文主要叙述制备转基因鼠的实验程序。
(一)不育雄性公鼠:结扎公鼠与母鼠交配以后产生假孕母鼠。受结扎的公鼠需8周以上,对种系无特殊要求。在正式实验前,结扎公鼠需与性成熟的雌性小鼠交配,反复交配两次或三次,经检查雌体有阴道栓,但均不怀孕产仔,则证明结扎成功。结扎公鼠使母鼠产生阴道栓的能力可维持2年。值得注意的是,如结扎公鼠与母鼠交配4~6 次均不能产生阴道栓,则该公鼠必须更换。
(二)假孕雌性母鼠:作为获得外源基因即转基因胚胎的养母,要求6周龄至5 个月较合适,对种系无特殊要求。其生殖系统的生理状态应与移进胚胎的发育阶段同步化,从而为移植胚胎提供着床和继续发育的生理条件。将选好的成年健康雌性个体与不育雄性个体进行交配,时间应与供体(取受精卵的雌体)同时进行。一般为下午4点钟合笼,次日晨选有阴道栓的待用。
(三)取受精卵的雌性母鼠:如果无特殊遗传背景的要求,一般用杂交F1受精卵较为理想。因杂交F1代胚胎的发育能力和对外环境的耐受能力都较强,有益于提高移植胚胎的出生率。在对遗传背景有特殊要求的情况下,供卵母鼠需选择种系,例如把一种鼠的等位基因转移到另一种不同等位基因的种系,这种卵供体母鼠必须有特定的遗传背景,因此需用纯系鼠。在实际操作中,一般用4~6周母鼠作为超排卵供体,3~4周母鼠产卵更多但卵细胞膜脆性较大,在处理过程中易破裂,而6周以后母鼠产卵逐渐减少。
(四)与卵供体母鼠交配的正常公鼠:公鼠性成熟约在6~8周,不同种系有些区别。每个作超排卵的母鼠与一只公鼠交配,次日上午检查是否有阴道栓并作记录。如两次以上都不能使母鼠有阴道栓,或总的阴道栓产生率低于60~80%,则需更换公鼠。

 

四、基因导入的方法
(一)显微注射法:在显微镜下,可借助显微操作仪,将毛细玻璃管直接插入受精卵的雄原核中(较大的原核),注入特定的外源基因,即为基因显微注射法。下面把利用显微注射法制备转基因鼠的方法和步骤简述如下。
1. 超数排卵(超排)与取卵
(1)超数排卵:在雌性动物发情周期的某一阶段,用促性腺激素促使卵巢里大量卵泡成熟并排出,称超数排卵。影响母鼠超排因素有母鼠的性成熟程度、营养、体重及母鼠种系。超排的更佳时间随种系不同而异,一般在3~5周,超过6周超排卵数明显减少。
在实际操作中常取4~6周龄的母鼠作超排卵供体,腹腔注射孕马血清(PMS) 和人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导母鼠排卵。PMS模拟卵泡刺激素(FSH)作用,hCG模拟黄体生成素(LH)的作用。二者注射时间间隔为42~48h,排卵发生在注射hCG后10~13h,注射剂量为每鼠5~10u。为了实验方便,常在下午注射PMS,隔日同一时间注射hCG,注射hCG 后每只母鼠置于一个单独饲养的正常公鼠笼内,次日晨检查阴道栓。
(2)取卵:用颈椎脱臼法处死有阴道栓的雌鼠,把完整的输卵管带一小段子宫剪下,置于PBS平衡盐溶液中,在解剖镜下找出输卵管伞部,用带4号针头的注射器将受精卵冲出,立即将卵子换至新鲜培养液内洗涤3~4次即可用于显微注射。
2. 注射外源DNA:显微注射需用显微操作仪,用来控制显微持卵针和显微注射针。持卵针是显微注射时固定受精卵的细玻璃管,管口平滑,通过一注射器控制持卵针,使其吸住要进行注射的受精卵。用来注射外源DNA的细注射针管表面平滑,锋利,便于注射时穿过透明带、细胞膜等。取已制备好的受精卵细胞和外源DNA悬液,在倒置显微镜下做显微注射。注射时先用持卵针吸住受精卵,再用注射针吸取外源DNA悬液,然后推动注射针,使其刺入受精卵的雄原核,将DNA注入。注射完毕,慢慢抽出注射针,将受精卵放入新的培养液中,使其恢复。一般50~80%的受精卵在显微注射后仍保持健康。
3. 注射后受精卵(或胚胎)的移植:注射后单细胞至桑椹胚的卵(受精后0.5天到3.5天)移植至受孕后的0.5天的假孕鼠的输卵管,输卵管移植需用被透明带包裹的卵。也可将注射有外源DNA的受精卵或桑椹胚体外培养至囊胚,再行移植。显微注射后3.5天的囊胚移植至受孕后2.5天的假孕鼠子宫,子宫移植不需要有透明带。
此法的优点是,在一定设备和经验条件下,实验过程大为简化;任何DNA 顺序都可直接导入原核内,导入的外源DNA在卵裂前与受体基因组整合,其缺点在于导入的外源DNA通常以多拷贝***的形式随机地整合于受体基因组中,妨碍其表达的正常调节。
(二)逆转录病毒感染法:以逆转录病毒作载体, 把重组的逆转录病毒载体DNA包装成高滴度病毒颗粒,感染发育早期的胚胎,将外源基因导入宿主的染色体内的方法称为逆转录病毒感染法。此法操作简单,可通过注射将重组病毒转移到囊胚腔内,也可将去透明带的胚胎与分泌重组病毒颗粒的细胞共培养,以达到将外源DNA 转移到胚胎中去的目的。
这一方法的优点是,重组逆转录病毒可同时感染大量胚胎。感染后的整合率高;外源DNA在受体细胞基因组中的整合通常是单拷贝的;不需要昂贵的显微注射设备。本法的缺点是,由于选用的受体是早期胚胎,不是受精卵,致使外源DNA 在动物各种组织中的分布不均,不易整合到生殖细胞中;由于病毒衣壳大小有限,限制了被导入的外源 DNA的大小,一般不超过15Kb。
(三)胚胎干细胞介导法:囊胚的内细胞团含有未分化的胚胎干细胞。体外建株的胚胎干细胞称为EK细胞(embryonic karyotype cell)或(embryonic stem cell)。 如果将EK细胞移植到正常发育的囊胚腔中,它们能很快地与受体的内细胞团聚集在一起,参与正常的胚胎发育。用重组的逆转录病毒作为载体感染EK 细胞, 再将此EK细胞移植入受体囊胚腔,可发育成携带着特定外源DNA的个体。
采用这一方法的优点是,外源DNA的整合率高; 整合在生殖细胞中的比例也很高。缺点是,EK细胞株不易建立,长期培养后出现细胞分化现象;生产的转基因动物都是嵌合体。
(四)精子载体法 将外源DNA与精子一起孵育,精子可捕获外源DNA,并通过受精过程将外源DNA导入受精卵。此法不仅可免去复杂而昂贵的设备, 且可省去不少繁杂的操作和条件准备。但该法有些结果不能重复。
此外,还有一些其它的方法,都有不同的优缺点。

五、转基因鼠的检测
待假孕母鼠产出幼仔后,可用幼鼠尾巴提取DNA;对于一些基因调控研究,需要尽快获得信息而暂不需保留转基因鼠,从胎鼠组织或幼鼠尾巴提取的DNA,可用PCR、Dot blot
(斑点杂交)、Southern blot(Southern转移)等多种方法分析以确定是否转基因鼠。

六、基因转移后的存在方式及表达
(一)外源基因导入后的存在方式:外源基因被导入受体细胞后,在受体细胞内的存在方式有三种:
1. 非同源重组。大多数外源基因导入受体细胞后,与受体细胞染色体的某一位点随机整合,这样可带来正常基因的插入、缺失、易位等突变。
2. 同源重组。导入的外源DNA与受体细胞染色体的DNA 通过顺序取代或顺序插入实现同源重组。通过同源重组有可能导致受体细胞正常的基因发生突变,当然,也有可能代替原来的有遗传缺陷的遗传基因,从而纠正遗传缺陷。
3. 游离存在。外源基因没有整合到受体细胞中,而是以附加体的形式游离在受体细胞内,能自我复制,并能100%的传给下一代。
(二)外源基因导入后的表达:外源基因导入受体细胞后能否表达,是受许多因素影响的。
1. 外源基因本身的结构和性质。
2. 附带的原核载体顺序。研究发现,原核载体的存在对α-甲胎蛋白、β- 珠蛋白等基因的表达具有明显的抑制作用,而对免疫球蛋白和胶原蛋白基因的抑制不明显。
3. 染色体位置。 外源基因在受体动物细胞染色体上整合部位的基因环境对外源基因表达的影响很大。
4. 甲基化。被转移的基因容易甲基化而失活。
外源基因在受体细胞中的表达方式表现为组织特异性和发育阶段特异性。组织特异性表达是由于某些调节元件如启动子和增强子的作用造成的。比如,免疫球蛋白基因只在B细胞中表达,原因是免疫球蛋白基因的启动子只存在于B淋巴细胞内,这是一类只在专一细胞中表达的启动子;另有一类可在多种组织细胞中表达的启动子,比如,人生长激素基因分别在肝与肾、淋巴器官和肌肉中表达。发育阶段特异性表达是指转基因在个体发育中的表达具有严格的时空特性,受到精细的调控。

实验动物的正确选择
实验动物的选择是医学科学研究中首先要考虑的问题。因为实验动物选择恰当与否关系到课题质量的高低、经费开支的多少、研究途径正确与否以及实验方法 的简单与繁琐问题,甚至会影响到课题的成败及研究结果正确性。因此,必须从观念上将实验动物的选择看作科技项目立项查新的文献检索一样,作为医学科研工作中的一个有机组成部分。同时,必须从实验动物学的学科高度给予足够的重视。其次,要了解实验动物学基本知识,这是正确选择实验动物的基本条件。

常用实验动物:
袋鼠(有袋目)、犰狳(贫齿目)、刺猬(食虫目)、蝙蝠(翼手目)、兔、鼠兔(兔形目)、大鼠、小鼠、地鼠、豚鼠(啮齿目)、江豚(鲸目)、海狗(鳍足目)、马、骡、驴(奇蹄目)、猪、牛、羊、鹿(偶蹄目)、狗、猫、鼬(食肉目) 、猕猴、黑猩猩(灵长目)等。

生物医学实验中选择实验动物的基本原则
1.选用与人的机能、代谢、机构和疾病特点相似的动物。
非人灵长类动物----进化程度更高,是最接近与人类的理想动物,如,猕猴。
其他动物----虽进化程度低些,但可以达到实验目的,如,犬、猫、猪等。
2.选用解剖、生理特点符合实验目的要求的实验动物、充分利用不同品种品系实验动物存在的某些特殊反应。
如:
开胸和心脏实验----适宜选用兔做实验;
发热、解热和检查致热源实验-----适宜选用兔做实验;

观察药物对排卵的影响,进行避孕药
研究-----适宜选用兔、猫;
动脉粥样硬化实验-----适宜选用兔、猪、猴;
肝外科实验研究------适宜选用大鼠;
胆囊功能研究------不能选用大鼠;
呕吐实验----适宜选用猴、猫;
变态反应、Vc缺乏症研究----适宜选用豚鼠;
对带有雌激素活性的药物进行避孕药效研究----不能选用小鼠、大鼠;
同品种不同品系的动物存在有很多特殊的反应,应注意选择应用。

3.根据课题研究目的内容选用
相匹配的标准化动物
标准化动物系指,经遗传学、微生物学、环境及营养控制而繁育的动物。
微生物学、环境及营养的控制才能排除动物因携带影响实验结果的微生物、寄生虫及潜在疾病对结果准确性的影响。
遗传学的控制才能排除实验动物因杂交、遗传学污染而造成个体之间的差异,影响结果的可重复性。

实验动物遗传类别选择
近交系----其动物遗传的均质性保证了实验反应的稳定性;
封闭群----能较好地代表自然群体的遗传特性;
F1杂交群----在一定程度上,兼有近交系和封闭群的特点;
突变动物----往往具有鲜明的人类疾病模型特征。

实验动物具体品种品系选择
如果实验结论只针对某一品系则使用一个品系;
如果实验结论针对整个物种在内的一般性研究则使用多个不同来源的品种、品系。
一般对多物种进行实验时,应先选小型动物,再推广到大型物种;要求只能建立在对多个物种进行实验的基础上,才能推广到人类,也称动物实验外推。常用顺序时小鼠、大鼠、兔、犬、猴。

微生物级别选择
普通级----一般为教学示范用;
清洁级----国内科研工作要求的标准动 物,适合于大多数科研课题;
SPF级----国际标准实验动物;
无菌动物-----仅在特殊课题需要时使用。

4.选用与实验要求相适应的实验动物规格
年龄----年龄不同,其生物学特性往往不同,一般选性成熟后的青壮年动物。太小的动物的生理功能未达到成年水平。太老的动物的各器官老化,代谢功能下降,只在老年医学研究中使用;
体重----在正常营养状态和饲养条件下,体重与年龄有一定的相关性;
性别----许多实验证明,同一品种(系)不同性别的动物对外界刺激的反应不一致。

5.选用人兽共患疾病的实验动物和传统应用的实验动物
有些病因造成人和动物共同患病,其临床过程、病理变化也相似,所以就应选用这样的动物来研究人类疾病;
选择科研、检验和生产中传统使用的实验动物。通过实践积累,各个专业均会在某些方面的课题选定自己常用的动物品种系。

6.实验动物的选择和应用需注意符合相应的国际规范
国际上普遍要求动物实验达到实验室操作规范(GLP)和标准操作程序(SOP)。这些规范对实验动物的选择和应用、实验室条件、工作人员素质、技术水平、操作方法都要求标准化。这是实验动物选择和应用的总的要求。
遵循国际上的3R规则-----减少动物用量、实验要精细、尽量采用替代物。

传出神经药理学实验中实验动物的选择
在测定新药的急性毒性实验(LD50)时,动物如出现竖毛,活动增加,激动兴奋,以致发展为强直一阵挛性抽搐,可初步考虑为拟交感药。进而可观察其动物(或猫)血压的反应,如兴奋α-受体,则对血压影响较大,并反射地使心率减慢,如兴奋β受体,可见血压下降和心率明显增快。为了较确切地区分其对α、 β受体的作用,还可采用α受体阻断药酚妥拉明,β受体阻断药心得安等作为工具。除血压实验外,尚可采用猫瞬膜,猫(或狗)在体肠活动等实验方法。利用一些 体外实验可分析拟交感药的作用部位,其中最敏感的实验之一是大白鼠胃底条,此外有兔头肌、离体兔耳、豚鼠气管链、豚鼠回肠和鸡盲肠等制备。可用已知的α或 β-受体兴奋剂作为标准,观察它们与α或β-受体阻断药的相互作用,而确定其作用部位。

乙酰胆硷具有毒蕈碱样及菸碱样作用,前者可被阿托品阻断,后者可被神经节阻滞药及横纹机松驰药阻断。凡是通过直接或间接作用兴奋副交感效应点的药物 可出现流泪、流涎、排尿和排便症候群。因此在小白鼠LD50实验中可获得初步印象,进而分别观察其对血压、唾液、瞳孔及胃肠道等反应。在猫血压实验、蛙 心、蛙腹直肌、水蛭背肌等标本上可检定拟胆碱药和观察抗胆碱药的作用,亦可用整体实验如抑制大白鼠胃溃疡,抑制大白鼠肠内活性炭下移等方法观察之。

消化道平滑肌实验中实验动物的选择
多种动物的离体肠道可用来试验传出神经药物,一般多用离体豚鼠及兔的肠道。豚鼠回肠的自发活动较少,描记时有稳定的基线,适合作药物鉴定用。兔肠 (尤其空肠)具有规则的摆动运动,适用于观察药物对此动物的影响。豚鼠回肠标本加负荷后已完全松驰,因此加入拟交感药不会使其更松驰。

离体豚鼠回肠可用于观察乙酰胆碱(Ach)和拟胆碱药的剂量-反应关系;可检定Ach和拟胆碱药的含量。离体兔空肠有节律性收缩活动,可观察肾上腺 素(4μg)、去毒豆碱(2μg)等药物对空肠摆动运动的影响。大白鼠胃底条是检定儿茶酚胺类药物和5-羟色胺(5-HT)最敏感的标本。主要观察药物对 胃纵行肌的作用,因标本中环形肌已切断。经检定儿茶酚胺对其敏感度要比大白鼠子宫标本大10~100倍。鸡食道由副交感神经支配,因此离体鸡食道标本适合 于试验拟副交感药物。由于其作用不能完全被神经节阻断药所阻滞,故不宜用于试验作用于神经节的药物。

心血管实验中实验动物的选择
血压实验是检验传出神经药物极其敏感的方法,一般采用急性血压实验,动物中以狗、猫、兔和大白鼠常用。兔不适用于降压实验,因其易于死亡。实验可用 麻醉或毁脑动物,因麻醉动物的血压常有三级波动(级波动,又称脉搏性波动,系每次心搏影响血压所致,第二级波动,又称呼吸性波动,即吸气时,血压微升,呼气时血压微降;第三级波动,系血管运动中枢以稍长间隔,兴奋性周期性改变),使血压升降不稳。如动物毁脑后,可排除脊髓以上的中枢神经神经对血压的 影响,只出现级波动,血压曲线极不平衡。
离体兔主动脉条实验:兔主动脉上含有α-受体,它是测定作用于α-受体药物的一个很好标本,已被广泛用来鉴定和分析拟交感药及其对抗药的作用。兔主动脉制备曾试制过多种形式,如主动脉环、片及条状等,但兔主动脉螺旋条是最合适的方法之一。此标本有较多优 点,如一个主动脉可制作3~4个标本,可供配对试验,对低浓度拟交感药就很敏感,组织稳定性好,可维持较长时间。

转基因动物激发光源

美国路阳生产有便携式荧光蛋白激发光源,能够方便快捷观察到转基因动物有没有荧光蛋白表达,LUYOR-3415RG便携式荧光蛋白激发光源能够激发转基因动物体内的荧光蛋白发出荧光,让科研人员无需昂贵的动物成像设备,通过荧光蛋白观察眼镜直接观察荧光蛋白的表达。目前,LUYOR-3415RG在中国很多高校的生命科学学院和医院得到了科研人员的认可。

转基因老鼠


【转基因动物的基因导入和检测】链接地址:https://www.luyoruv.com/new3/transgenicanimals.html
未经公司同意,严禁转载我站文章,经同意转载的,必须注明出处。