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实验室抗体保存指南

作者:生命科学事业部时间:2019-12-01 09:17:34浏览349 次

信息摘要:

很多抗体的更佳保存条件是分装成小包装冻存于-20°C 或-80°C。分装能使冻融引起的损失减到最小,同时可避免多次在一个管内取样而由枪头引入的污染。分装冻存的抗体,融解一次后剩余抗体应保存于4°C。收到抗体后,应10,000 x g 离心20 秒,使管口螺纹内的抗体溶液全部离心至管底,用低蛋白吸附性的微量离心管分装。

抗体保存指南
不同类型抗体储存时注意要避免污染或损失

保存温度和条件
很多抗体的更佳保存条件是分装成小包装冻存于-20°C 或-80°C。分装能使冻融引起的损失减到最小,同时可避免多次在一个管内取样而由枪头引入的污染。分装冻存的抗体,融解一次后剩余抗体应保存于4°C。收到抗体后,应10,000 x g 离心20 秒,使管口螺纹内的抗体溶液全部离心至管底,用低蛋白吸附性的微量离心管分装。分装量的多少取决于每次试验的使用量。分装量不能少于10μl;分装量越少,由于蒸发和吸附于管内壁而引起的损失会越大。除了腹水液含蛋白酶应立即冻存外,大多数抗体接收后可在4°C 保存一至两周,随后可冻存以长期保存。同样,应按照说明书推荐的条件进行保存。

免责声明和其他特殊情况
酶联抗体,不应冻存,4°C 可保证稳定。冻融会降低酶的活性,同时影响抗体的吸附能力。偶联标记的抗体,无论是标记的荧光染料、酶还是生物素,都应保存于深色的管内并包裹上铝箔。如果暴露在光线下可能会减弱偶联标记物的活性。荧光标记物尤其容易受到光漂白作用,整个实验过程中均应避光。免疫球蛋白G3 同种型抗体冻融后易形成聚合物,因此应一直保存于4°C。

用叠氮化钠防止污染
为防止微生物污染,在抗体溶液中应加入叠氮化钠,终浓度为0.02%(质量百分比)。很多Abcam 的抗体已经包含了0.02-0.05% 的叠氮化纳,在说明书的“保存缓冲液”部分会有描述。

什么时候不能用叠氮化纳
如果用抗体标记活细胞,或用于体内实验,确保所用制剂中不含叠氮化钠。这种抗生素对大多数有机体都有毒性:会阻断细胞色素电子传递系统的信号。
叠氮化钠会干扰胺基的偶联标记,应在进行标记之前将其除去。标记后抗体可保存于叠氮化纳,也可用不含胺基的硫柳汞替代。叠氮化钠可用透析或凝胶过滤法从抗体溶液中除去。免疫球蛋白G 的分子量是150,000 kDa(免疫球蛋白M 的分子量是600,000 kDa),叠氮化钠的分子量是65 道尔顿。使用14,000 kDa 的微量透析装置,随着叠氮化钠的扩散,抗体将保留。将带有烧杯的磁力搅拌器置于4°C搅拌透析装置6 小时,每毫升抗体溶液要用至少1升的磷酸盐缓冲液。更换2 次磷酸盐缓冲液,每次均搅拌至少6 小时。如果可以的话,所有材料均要求无菌,所有溶液都应无菌配制。

冻存/复苏的损失
反复冻融可使抗体变性,使其形成聚合物而降低了抗体结合能力。大多数抗体在-20°C 保存就足够了,没有必要置于-80°C 保存。千万不要使用无霜的冰箱。反复冻融能减少霜的形成,但这正是应该避免的。同理,抗体应该放置于冰箱中温度变化最小的部位,如应放置于冰箱格里,而不应放置于冰箱门上。一些研究者为防止反复冻融的损失,在抗体中加入终浓度为50% 的甘油作为抗冻剂。甘油可以将冰点降低至-20°C 以下。很多抗体都可以这样做,本公司提供的抗体只有一小部分测试了这种保存条件下的稳定性,我们只保证那些按照说明书推荐条件储存的抗体有活性。由于-80°C 低于甘油的冰点,所以加了甘油的溶液不应保存于-80°C。注意,甘油可能会被细菌污染。如果要加入甘油或其他防冻剂,应注意无菌处理。

稀释至工作浓度的抗体更好不要在4°C 保存超过时间。通常蛋白质在较高浓度保存时不易发生降解,理想浓度为1mg/ml 或更高,因为抗体溶液中包含了如牛血清白蛋白等蛋白质稳定剂。加入的蛋白可吸附于管壁从而使抗体的损失减到最小。对用于聚合的抗体,不应加入蛋白稳定剂,因为其可能会与抗体竞争而降低抗体的聚合活性。


抗体选择:

选择一抗宿主的类别
一般来说,当用标记二抗来检测非标记一抗时,产生一抗的宿主动物的类别就非常重要。对于免疫组化,产生一抗的宿主应尽可能的和样品的宿主种类不同,以避免二抗的免疫球蛋白与样品中内在的免疫球蛋白发生潜在的交叉反应。例如,用于检测鼠源蛋白的一抗就不应来源于鼠或大鼠,来源于兔则是比较适合的选择,接下来用检测分子(酶、荧光、生物素等)标记的抗兔IgG 的二抗进行结合。如果有已标记的一抗则可以直接避免上述交叉反应发生。对于不含内源性免疫球蛋白样品的检测,宿主的种类选择不用很严格。例如进行western blotting 的细胞裂解液就被认为不包含IgG。而组织溶解液和组织培养上清(包括血清)则被认为是含免疫球蛋白的。Westernblotting 时IgG 会以50 和25kDa 的条带出现在降解和变性样品中,分别相当于IgG 分子的重链和轻链。

选择二抗
二抗应来源于抗一抗的物种。举例来说,如果您的一抗来源于鼠,那么二抗就应该选择抗鼠的。我们建议仔细核对二抗数据表以确定您要使用的二抗。Abcam提供有大量标记各种荧光物质和染色物质的二抗。检查您所用的一抗数据表的底部,将会显示一些合适的二抗。为了找到您自己的二抗,可以使用我们的导航框或通过主页中心的链接来选择产品类型,然后选择您一抗的种类,这样会显示大量适用于一抗种类的二抗。

双重染色抗体的选择
对细胞培养液或组织上清液进行双免疫染色要求非标记一抗来源于不同物种的动物,而二抗则特异性识别其中一种一抗。二抗如果与其他动物来源的免疫球蛋白有交叉吸附,则会在数据表中明确说明。

荧光和染料标签
标签结合在抗体上使抗体的结合可见。标签的选择依据以下几个方面:
1. 检测方法:荧光或有色沉淀。荧光标签会在特定波长的光激发下发光。根据它们自己激发和发光性质不同,有一些荧光标签是可用的。在结合了合适的底物时,酶标签HRP和AP可以形成有色沉淀。
2. 有效的封固剂(只限免疫组化):AEC、Fast Red、INT或是其它的水溶性染色剂均溶于酒精,因此要求使用水溶性封固剂。以上提到的其他有机物要想得到较好的折射率,更好使用有机封固剂封固。荧光素标签需要水溶性封固剂。胆藻素蛋白(藻青蛋白/藻红蛋白)需要不加甘油的水溶性封固剂,否则会产生淬灭效应。
3. 生物素标记的抗体对于信号的放大是很有效的,比如可应用于亲和素-生物素-酶或荧光复合物(通常缩写为ABC试剂)或者亲和素或链霉亲和素结合酶或荧光染料检测法。


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