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农杆菌转化拟南芥

作者:生命科学事业部时间:2019-11-28 21:50:26浏览283 次

信息摘要:

农杆菌是一种革兰氏阴性细菌,它对寄主细胞的转化是借助诱导瘤细胞(tumor-inducing, Ti)质粒将其中一段特定的DNA片断转入寄主细胞基因组的过程。在自然环境中,被转移的DNA (T-DNA)携带了一套致瘤基因和冠瘿碱代谢基因,它们在植物中的表达可引起被侵染组织产生肿瘤并合成冠瘿碱作为细菌的氮源。利用分子克隆技术可以将T-DNA替换为目标基因,使农杆菌成为一个能有效将外源基因导入植物的天然工具。

农杆菌转化拟南芥
1.农杆菌感受态制备

① 从 YEB 平板培养基上挑取农杆菌单克隆,接种于 5 mL YEB (含 50µg/mL 利福平)液体培养基中,28ºC,200 rpm,过夜培养;
② 取2 mL过夜培养液接种于50 mL上述含有利福平的YEB液体培养基中,28ºC,200 rpm,摇床培养至 OD 达到 0.5;
③ 菌液冰浴 30 min,转至预冷的 50 mL 离心管中,4ºC,5000 rpm,离心10 min,收集菌体;
④ 2 mL 预冷的 50 mM 无菌 CaCl2 溶液(含 15%甘油)悬浮菌体,即为感受态细胞;以 100 µl/管分装,液氮速冻后,保存于-70ºC 冰箱,备用。

2.质粒转化农杆菌感受态
① 吸取构建好的表达载体质粒 5 µl,加入到 100 µl 感受态细胞中,混匀;
② 冰浴 30 min,液氮冷冻 5 min,37ºC 热击 5 min;
③ 加入 800 µl YEB 液体培养基,28ºC,200 rpm,摇床培养 5 h;
④ 离心,留 200 µl 上清重悬沉淀,将菌液涂于 YEB 固体培养基(含质粒对应的抗生素),28ºC 培养 2 d,挑取单克隆,检测筛选阳性克隆,摇菌后-70ºC 保存,用于下一步植物转化。

3.农杆菌侵染拟南芥花序
① 将筛选的阳性农杆菌在 YEB(抗生素)固体培养基划板培养,至长出单克隆后挑 3-5 个单克隆,于 5 mL YEB(抗生素)液体培养基中,28ºC,
200 rpm 培养 16 h,(以培养基变得很浑浊为准),保菌之后全部接到250-500 mL 的培养基中,培养 16 h 以上;
② 5000 rpm 离心 20 分钟,然后用转化液(1/2MS(只用大量和微量元素),添加 50 g/L 的蔗糖,调 pH 为 5.8 左右,然后加 200 ul/L 的 Silwet L-77混合),剧烈悬浮沉淀至完全悬起;
③ 在拟南芥盛花期,将悬浮液直接浸泡地上部分约 1 分钟,然后用保鲜膜
完全包裹以保湿,放回培养室 12 小时以上打开保鲜膜;
④ 待种子成熟后(半个月左右),收取种子用于下一步筛选工作。

农杆菌介导转化的拟南芥

4.拟南芥转基因苗筛选
① 种子消毒:用 75%的酒精添加 0.1%的 Triton X-100 在 1.5 mL 的离心管中摇晃 15 min,然后在超净台中用 95%的酒精洗两次,最后一次直接把种子连同酒精倒在灭菌过的滤纸上,滤纸直接放在超净台上,吹干种子(30min 以上),然后把滤纸对折,左手捏着一角,右手拿一把镊子轻轻敲击滤纸把种子均匀撒到筛选培养基上;
② 抗性苗筛选:MS 培养基中加 25 mg/L 的氨苄青霉素,抑制细菌的生长;根据质粒抗性,在培养基中还得加 20 mg/L Basta 或 25 mg/L 潮霉素。筛选培养 15 d 左右,把阳性苗转移到土中,用透明的薄膜盖 3 d 左右以保湿;
③ PCR 鉴定:提取抗性苗 DNA,外源基因特异引物检测基因整合情况;
④ 荧光定量 PCR 分析:提取抗性苗 RNA,外源基因特异引物检测基因表达情况。


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