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质粒的纯化和问题解答

作者:生命科学事业部时间:2019-11-16 08:26:32浏览101 次

信息摘要:

质粒是能够自主复制的小型环状DNA分子,多存在于细菌及酵母菌等生物中,是基因工程中最常用的运载体,担负着将目的基因转移到宿主细胞中的重要使命。基因表达载体的构建(也就是目的基因与运载体结合)是基因工程的核心步骤,用作运载体的质粒更是掌上明珠。我们需要从细菌中分离出质粒以备后用。

质粒
质粒是染色体外的小环状脱氧核糖核酸(DNA),其独立于染色体DNA复制。尽管发芽酵母和裂变酵母可以保留质粒,但质粒的宿主几乎是细菌。这种小的环状DNA被广泛用作分子生物学,生物化学,生物技术,细胞生物学等领域的DNA载体。这意味着质粒纯化/分离是这些研究领域中非常基础的实验,并且该实验几乎每天都在几乎每个实验室中进行。质粒是能够自主复制的小型环状DNA分子,多存在于细菌及酵母菌等生物中,是基因工程中最常用的运载体,担负着将目的基因转移到宿主细胞中的重要使命。基因表达载体的构建(也就是目的基因与运载体结合)是基因工程的核心步骤,用作运载体的质粒更是掌上明珠。我们需要从细菌中分离出质粒以备后用。

质粒

摇菌培养
即培养细菌使质粒扩增
1.将鉴定测序正确的克隆菌液涂在LB固体平板(一种培养基,使质粒扩增)。
2.置于37℃恒温培养箱,培养12-17h,待长出菌落。
3.灭菌15ml离心管内加入5ml含抗生素的LB液体培养基,编号标记。
4. 挑取单克隆菌团放置液体培养基,每个培养基放置1个菌落。
5. 37℃,180rpm,振荡培养过夜。

收获细菌并裂解
1.离心扩增好的菌液,按说明书将菌液重悬,转入1.5ml离心管中。
2.用质粒小量抽提试剂盒,按说明书要求提取质粒。
3.细菌高速离心1min,彻底去除上清。
4.加入250ulRB溶液,振荡器充分悬浮细菌。
5.加入250ulLB溶液。立即上下颠倒10次,使细菌裂解,室温,放置2min。
6.加入250ulNB溶液。立即上下颠倒10次,使之充分中和,室温,放置2min。
7.室温,1500rpm,高速离心15min。
8、将吸附柱放入收集管内,离心得到的上清转移至吸附柱,室温,15000rpm,高速离心30s。
9、弃废液,将吸附柱放入收集管,加入700ul WB溶液到吸附柱中,15000rpm,高速离心30s。
10、重复上一操作。
11、将吸附柱放入干净的1.5ml 离心管中,加30-50ul预热的Elution Buffer,室温,放置2min,高速离心1min。
12、样品进行电泳检测:1%琼脂糖凝胶电泳,上样量为2ul,紫外灯下观察,最明亮的带为超螺旋形式,可以在一定程度上表明提取质粒的纯度。

质粒的纯化
1. 将之前提取好的质粒放入1.5ml离心管中,加入1/10体积的3mol/L 无菌乙酸钠溶液。
2. 加入2倍体积的无水乙醇,放置于-20℃沉淀4-6h或过夜。
3. 4℃,高速离心机14000rpm,离心20min.
4. 弃去上清,70%乙醇洗2次。
5. 空气干燥,可置超净工作台干燥。
6. 加200ul无菌水溶液干燥后所得沉淀,即为质粒溶液。
7. 紫外分光光度计测量质粒浓度和产量。

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质粒纯化故障排除
质粒DNA纯化(众所周知的质粒制备)是实验室中最常用的方法之一。准备包括;细菌培养物的生长,细菌细胞的收获和裂解以及质粒DNA的纯化。纯化的质粒DNA进一步用于下游过程,例如:克隆,基因转移,转化或测序。可以改进几个步骤以获得更高的产量或消除最终产品中的污染。
如果您遇到问题,请不要担心!故障排除指南可为您提供帮助。

细胞裂解不完全
细胞密度过高:减少培养体积。
细胞沉淀未完全重悬:在细胞裂解前,使用适当的缓冲液或溶液适当重悬细胞沉淀。
碱裂解步骤不足:检查裂解溶液中是否有盐沉淀。

DNA或RNA污染
基因组DNA污染:在裂解和中和步骤中,请勿过度剧烈涡旋细胞。
冻干的RNase不能完全溶解:按照方案中的说明溶解RNase。
RNA污染:使用前,将RNase加入重悬溶液中。
细菌细胞过多:减少培养量,以免反应或色谱柱超负荷。
文化太老了:不要使用培养时间超过24小时或已经处于死亡阶段的文化。

产量低或没有
培养体积太高:减少培养体积以增加裂解细胞的数量。
质粒不繁殖:使用新鲜条纹细菌细胞进行接种。
选择性压力太低:在培养过程中使用适量的抗生素,以避免没有目的质粒的未转化细胞过度生长。
未立即处理培养物:始终使用新鲜种植的培养物。如果您需要另的准备工作,沉淀细胞,除去培养基,然后将细胞沉淀保存在-70°C。
套件组件的有效性降低:将套件组件存储在适当的条件下。
洗涤液浓度过高:盖紧瓶盖,避免乙醇蒸发。

下游流程性能不佳
其他质粒形式包括:避免质粒DNA变性-不要延长细胞裂解时间,不要超过实验方案的建议。
质粒DNA浓度太低:沉淀质粒DNA并以较小体积重悬以浓缩DNA。
重悬的质粒DNA中存在乙醇:增加干燥时间。

质粒纯化技巧
在质粒制备过程中,请确保使用诸如乙酸钠之类的盐以帮助核酸从溶液中沉淀出来。
带正电荷的钠离子与质粒的糖-磷酸主链反应,使质粒更疏水,在水中的溶解度更低。
乙酸钠在DNA质粒纯化中特别有效
使用氯化锂作为盐纯化RNA质粒
在质粒制备过程中,如果样品很小,体积足够或需要更长的存储时间,请确保使用乙醇作为溶剂。

核酸和盐都比乙醇难溶于异丙醇。
如果您只能将1体积的酒精放入1体积的DNA样品中,请改用异丙醇
在质粒制备过程中,确保将DNA,乙酸钠和乙醇混合物在至少-4°C的温度下孵育大约20分钟。但是,优选-20℃或-40℃。
如果产量低,请尝试将孵育时间延长至30-60分钟
其他技巧
质粒制备中不要使用过多的生物量。

 


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