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如何将外源基因在酵母中高表达?

作者:生命科学事业部时间:2019-10-25 09:22:30浏览226 次

信息摘要:

酵母表达系统是广泛应用于外源基因表达的系统之一,酵母作为基因工程表达系统,既有原核生物那样生长、繁殖快速和表达量高的特点,又具有与高等真核生物十分相像的蛋白质翻译后加工和基因表达调控的特征。长期以来酵母作为工业微生物的主要菌种,在工业化发酵方面已经积累了大量的经验。利用酵母进行重组蛋白生产,只有表达产量和质量都合格才能够得到应用

如何将外源基因在酵母中高表达?

酵母表达系统是广泛应用于外源基因表达的系统之一,酵母作为基因工程表达系统,既有原核生物那样生长、繁殖快速和表达量高的特点,又具有与高等真核生物十分相像的蛋白质翻译后加工和基因表达调控的特征。长期以来酵母作为工业微生物的主要菌种,在工业化发酵方面已经积累了大量的经验。利用酵母进行重组蛋白生产,只有表达产量和质量都合格才能够得到应用,酵母对外源基因的表达水平受很多因素的影响:
在基因水平:提高和控制外源基因的转录水平是提高表达水平的有效方法之一,所以筛选高效启动子就十分重要。另外表达载体在细胞中的拷贝数和稳定性对外源基因在酵母中的表达也有明显影响。
在蛋白水平:要考虑表达产物的可靠性问题,其中包括外源基因在表达系统中的遗传稳定性、不同生物来源的基因在酵母中表达后加工和修饰的情况等因素。

外源基因在酵母中高表达

当遇到外源重组蛋白的表达产率低,产物无活性或被降解的情况或没有检测到蛋白表达,则应该从以下几个方面进行改进:

1 外源重组蛋白的毒性:
首先确定外源蛋白是否对酵母细胞具有毒性,如果有毒性则选择诱导表达系统尝试表达;

2 目的蛋白的降解及稳定性:
重组蛋白的稳定性是提高蛋白表达量的一个重要因素,如果在表达中有蛋白质降解现象,即使采用高密度培养酵母以提高发酵液中的蛋白含量,但由于相应的蛋白酶的含量也随之增加,目的蛋白的积累会受到严重影响,所以细胞中蛋白酶的水平决定目的蛋白的最终产量。为了提高目的蛋白的表达产率,可以采用以下策略:
(a)选择蛋白酶缺陷的菌株,避免表达产物的降解,提高目的蛋白的积累量;
(b)在培养基中添加富含氨基酸的组分和酪蛋白的水解物,胃蛋白的水解物,降低对目的蛋白的水解速度;
(c)采用非缓冲体系的培养基,通过pH的改变降低蛋白酶的活性,减少对表达产物的降解量。

3 信号肽的选择:
分泌表达重组蛋白是一种获得目的产物的理想方法,因为它一方面可以简化后期的分离纯化工艺,另一方面可减轻细胞的负荷,提高细胞生产蛋白的能力。还可以减少蛋白酶对目的蛋白的水解机会。研究者将酿酒酵母的α-因子信号肽的前信号序列融合到人肿瘤抑制因子P53的cDNA区在毕赤酵母中构建MUTs,发现其对人肿瘤抑制因子P53 的表达量比传统中使用的S.cerevisiaeyP3的表达量高。YuMingrui在毕赤酵母中表达来源于Yarrowia lipoytica的Lip2 酯酶时,通过导入酿酒酵母α-因子信号肽,实现了目的蛋白的高效表达。但信号肽如果选择不佳,会使蛋白质分泌量少或者没有进行分泌表达。

4使用多拷贝序列:
外源基因在酵母表达系统中的拷贝数影响外源基因的表达水平, 一般来说整合的拷贝数越多,蛋白的表达量越大。如鼠的表皮生长因子(EGF)、人肿瘤坏死因子(TNF)。目前常用提高外源基因整合拷贝数的方法是a)通过不同的转化方法提高整合拷贝数;b)在体外载体上多次插入目的基因片断;c)将载体中的基因两端连上来自宿主或其他非必需高重复的基因片断,通过同源重组而达到高拷贝整合的目的。

5提高发酵水平:
酵母表达系统是一类真核生物表达系统,它能使表达产物糖基化,其细胞的组分和代谢产物对人体无毒,而且还可以在简单又廉价的培养基上生长并达到高细胞浓度,因此酵母表达系统一直是进行重组蛋白发酵生产的选择。通过选择发酵参数,如温度、时间、pH、通气量等,和改善培养基的组成,优化发酵工艺、提高发酵产率。甲醇可以诱导AOX启动子驱动重组蛋白表达,也可诱导蛋白酶的表达,而用于培养的碳源甘油对AOX启动子有抑制作用。所以在利用甲醇诱导外源蛋白表达时,要注意甘油和甲醇的加入量。甘油的添加量应该在诱导时被消耗尽,而甘油的添加量取决于培养条件和转化子。

6检查是否有提前终止转录发生:
如果有则要考虑目的基因序列中的AT含量,进行序列的优化;例如序列中含有TTTTTATA,类似于HIV-1 gp120 基因的ATTATTTTATAAA,会出现提前终止转录。(还有一种情况就是克隆构建的时候因为移码等原因导致的表达提前)

7表达产物的糖基化:
酵母表达体系有时候会使表达产物过糖基化影响表达产物的活性。可尝试进行胞内表达, 不通过分泌表达则蛋白质不会被修饰;或者采用N-GlycosidaseF对蛋白质进行去糖基化;也可以改造基因去除N-糖基化位点(Asn-XSer/Thr)。外源基因在酵母中高表达

Over-expression of Trimastix proteins in yeast. The over-expression of GFP tagged proteins of Trimastix in Saccharomyces cerevisiae . The columns represent the signals from GFP tag (green), MitoTracker (red), merged GFP and MitoTracker and DIC. Rows represent individual proteins: cpn60, P1-protein of GCS, H-protein of GCS and H-protein of GCS truncated of the first 16 amino acids. doi:10.1371/journal.pone.0055417.g001 

A30P-synuclein-aggregate-formation-upon-high-copy-expression-in-yeast-Live-cell (1).png

synuclein aggregate formation upon high copy expression in yeast. Live-cell fluorescence microscopy of yeast cells expressing ␣ -synuclein-KLID-GFP from high copy plasmids was compared with immunofluorescence of untagged ␣ -synucleins. Yeast cells pre-grown to mid-log phase were induced in galactose-containing medium and examined for aggregates at 8 h of induction. GFP-expressing cells were used as control. Aggregate formation of untagged WT, A30P, and A53T ␣ -synuclein was visualized by immunofluorescence. N-terminal eGFP-tagged ␣ -synuclein via SAAAG linker and ␣ -synuclein C-terminally fused to myeGFP was employed for further comparison. White arrows point at intracellular inclusions. 

 


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