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westernblot常见问题

作者:生命科学事业部时间:2019-10-25 13:38:36浏览167 次

信息摘要:

Western免疫印迹,是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,探针是抗体,显色用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

westernblot常见问题
1. 用的是Santa Cruz的抗体,也实验过一抗和二抗肯定能结合,二抗加DAB肯定能显色。电泳的胶用考马斯亮蓝染色没问题,但是不知道与Marker对应的条带是否是我要的(我目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD)。半干法2小时转膜后,丽春红染色发现大分子量蛋白转过去的较少。难道是裂解液出了问题?我用的是三去污剂,但没加叠氮钠和大概叫Apoptin的那种蛋白酶抑制剂。冰上裂解 -80度冻存的细胞,4度12000g离心5分钟,取上清,与分子克隆(第二版)上的加样buffer混合,沸水变性5分钟,上样。不知道是哪里出了问题?
解答:建议:a、首先确定您提的蛋白质量如何?可用PIERCE公司的BCA试剂盒测蛋白的浓度,一般来讲,其浓度应该在几-20微克/微升。
b、若是蛋白没问题,哪就看是不是电泳的问题,首先要看胶的浓度,您目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD,建议分别用10%和12%的胶。60-80V,1小时左右。跑过积层胶与分离胶的线时,换用100V,3-4小时。
c、转膜,建议恒压,15V,不用转2小时,45分钟足以。您所说的大蛋白转过去的,并不是真正的少,而是因为在提的蛋白中大蛋白本身就很少。我曾经也转过2小时,但和45分钟的区别并不大。
d、根据MARKER的条带(我的是7条带:14、18、25、35、45、66、116KD),您根据MARKER的条带剪下25与35之间(29KD)的条带,45-66之间(50KD)的条带。这样,可以节省抗体,第二,您要的目的条带肯定在上面。
e、延长1抗、2抗孵育时间(我曾室温1小时,4度过夜),适当加大1抗浓度。
f、我买的也是Santa Cruz的抗体,我觉得质量还可以,我想您应该先找其他方面的原因。

2. 电泳用的是恒流,一块胶,20mA,100分钟左右。转膜也是恒流,38mA,100分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反应体系下做出来了,当然彼此的目的蛋白不同。所以,我想问题应该出在抗原和一抗上,不知对不对。
解答:电泳的条件:样品的分子量决定了胶的浓度,一般使样品跑至胶的中部即可。正常条件下,电泳时溴酚蓝和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以决定电泳的电压和时间。建议你用恒压80-100伏。

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3. BIO-RAD的半干转运系统有一个很致命的弱点就是无法控温(我用的就是这种),当电流过高,而系统的散热又比较差,滤纸的吸水性比较差的情况下,就很容易烧胶。
就转膜时,是采取恒压还是恒流的问题,我想和大家探讨一下,我感觉我这个系统用恒流很容易烧胶,我的胶有68cm2,用50mA恒流来转膜,刚开始电压就很高,有20 v左右,而用恒压,开始电流有110mA,但15min后,电流就降到8OmA,30min后就稳定在40mA,不就相当于恒流吗?
解答:恒流时电压逐渐升高的原因是湿滤纸逐渐变干因而电阻逐渐增大的缘故,如果电压升得太快,可以使滤纸更湿一些以克服。就我的感觉,20V的电流30min以后20Kd以下的分子丢失很多,不过我用的是小胶40cm2,不知有无不同。

4. 我想尽量提高转膜的效率(我的实验要求转到膜上的蛋白越多越好,不管是什么大小蛋白)不知道有那些办法?
解答:不管怎么转都会存在蛋白转移不完全(电压过小时间过短)或过度转移(电压过大时间过长)的问题,鱼(小分子量蛋白)和熊掌(大分子量蛋白)不可得兼呵呵。建议把胶切成两半,比如以35KD为界,分别进行转膜,下半时间短,上半时间长一点,应该会好一些。

5. 请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么?
解答:一般而言,硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联,这样的话,反复洗几次后,蛋白容易掉下来,结果较差。尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合(注:常用的PVDF即带正电荷的尼龙膜),同时也有疏水作用,但相对较弱。这样的话,PVDF膜和蛋白接合较牢,不易脱落,结果较好。

6. a、煮好后的样品,若没有及时上样分离,应如何保存,可以保存多久?b、有没有人在用bio-rad的小型垂直电泳槽,有没有操作手册?c、湿式转移时是否必须要用bio-rad的专用滤纸?d、恒压转移的条件如何确定,因为我要分离小至21KD,中至66KD,大致170KD的蛋白质,转移条件能够相同吗?e、凝胶的浓度是不是可以用一个浓度?书上写不同的凝胶浓度分离的分子量范围不同,还给出了一个线形范围,是不是不在这个范围内也能分离,只是就不是线性范围了?
解答:
a、煮好后的样品,放到-20,我们在一个月后此样品,效果一样。
b、bio-rad的小型垂直电泳槽的操作手册在他们的主页Bio-Rad USA上有。
c、转移时一般的WATERMEN滤纸就可以。
d、转移条件是和蛋白质大小有关的:以次确定电压和时间。具体可让ptglab帮你定夺。
e、凝胶的浓度也是和分离蛋白质大小有关。不是随心所欲选的,否则分离效果可能不是你所期望的。

7. 怎样设计实验来确定更佳的条件?
解答:随便说一点, 具体的还是需要自己想:
a、在每个上样孔里上同样的蛋白样品,量也一样,更好是组织样,(也可以跑1 个大 well, 不插梳子,多上样,)SDS-page;
b、转移, 设定电流或电压;
c、每隔 1(or n) 小时,取一点膜染色,看转移效果。

8. 我要测两种抗体,一种为磷酸化的目的蛋白,一种为总的目的蛋白,不知道用什么方法strip更好,我用甘氨酸(PH2.9)漂洗15分钟,似乎没什么效果?
解答:你可以加巯基乙醇(loading buffer 一样的浓度),56度, 30mins,看看。

9. a、在用PBS洗涤抗原-抗体-ProteinA-Agarose复合物时,每次要重悬多长时间合适?b、最后用2xSDS重悬抗原-抗体复合物离心后,由于2XSDS中已经加入了溴芬兰,因此下面的Agarose珠子几乎看不到,所以吸取上清加样时也不知道里面是否吸进了Agarose。不知有什么方法可以解决这个问题,或者即使吸进了一些Agarose也不要紧呢?
解答:a、不用重悬多久,重悬起来了就可以离心了。
b、加2X BUFFER前大体上已经知道有多少胶粒了,吸到那个位置时小心点就是了。我也试过一些次,首先离心稍微长一点,长20秒吧,希望胶粒能沉得结实点(我想象的),再吸取。如果感觉枪头不是很顺畅的时候可能就是碰到胶粒了。很难一点胶粒也吸取不上来的,尽力做好就是了。

10. 磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等?
解答:NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂,一般更好加。但是不加也可以,大部分时候是不用加的。我做的时候从未加过,都做出来了。

11. Western Blot中block的最短时间?
解答:每一步1小时足够了, 中间换抗体要洗的话多换液几次,每次时间10分钟就够,洗3次只要半小时。跑胶1小时, 转移1小时,block半小时就行,1抗1小时,洗半小时,2抗1小时,洗半小时,显色10分钟。一般跑两块胶,一块染色, 一块western。肯定完事,一般不用等到第二天。

12. 想用Western检测基因转染后细胞培养上清中表达的目的蛋白(定性),分子量为20KD,浓度约为几百ng/ml。蛋白样品需浓缩、纯化吗?如何浓缩、纯化上清液中的目的蛋白?对小分子蛋白Western blot时需特别注意哪些条件?
解答:按照你提供的浓度,如果做Western Blot,是不用浓缩样品的. 对于20kd的小分子的蛋白,Western Blot中要注意的是:
a、转移时的时间,
b、转移时的电流或电压.
c、transfer buffer 中加20%的甲醇.
d、可以用13-15%的分离胶.

13. 蛋白分子量大小分别为21kd、28kd,用的是湿转,请问多大电流,多长时间比较合适?
解答:分子量比较小,更好是用干转,湿转效率太高,易转过了。干转的话,用2.5 A/cm2, 30min就应该够了。湿转,按照bio-rad的说明,用100mA,也得要半个多小时吧。

14. 需要测同一种蛋白质的总量与磷酸化的量,但相互间干扰太大,怎么办?
解答:将膜放入stripping buffer(SDS 2%,Tris·Cl (PH=6.7) 62.5mM,beta-巯基乙醇 100mM)中,50℃孵育30分钟,TTBS西三次,再重新加入一抗,进行另一种抗原的检测。

15. 做Western Blot实验时,发现转膜时的电流总是偏小,转膜的效率也偏低. 100V恒压转膜时的电流只有190mA左右,而以前都有250mA。体系和条件都和以前一样,只是环境温度比以前低了很多。
解答:有可能重复使用了转移缓冲液,随着离子的逐渐减少,电阻越来越大,当然恒压时电流越来越小了。建议更换转移缓冲液。反复使用不要超过三次。环境温度低是有利于转移的。

16. 目的蛋白是一种6KD的分泌性蛋白,RT-PCR就显示细胞中mRNA表达不高,估计将培养上清冻干浓缩后采用Western Blot还可能检测不出,但如果用western,是否一定要用0.2μm的膜?用Tris-tricine SDS-PAGE电泳,电泳时分别管制三层凝胶,分离胶用40%T丙稀酰胺(2.6%C)浓度为16.5%,另外两层都用30%丙稀酰胺,中间一层浓度为10%,积层胶浓度为4%,凝胶厚度1mm,转膜的条件试过30V70分钟,膜上可见到小分子蛋白marker的条带,似乎见到目的条带,上样量为60μg细胞胞浆总蛋白,转膜的条件怎么样合适?
解答:一定要用0.2μm的膜,并且转移的条件要摸索一下,小分子的Western不好做,要根据你的实验器材来定,一般你要是有prestained marker就可以参照一下,如果相应的分子量大小的marker转移的好就可以了。

17. 怎样才能把胶跑的非常漂亮,泳道和band都能很直,是不是上样的量很重要,罐胶有什么技巧吗?想跑漂亮,是不是应该先小电压,再高电压,总体上电压小些会跑的好些?还有前面有人说电泳液平玻璃板会使电泳条带漂亮些?
解答:影响跑胶跑的质量,有以下几个因素:1、电压,小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小,条带越漂亮,浓缩胶80v,分离胶100v就能跑得很好。2、胶的均匀度,胶越均匀,条带越窄,分离越均匀。倒胶之前,一定要充分混匀,玻璃板一定要干净,双蒸水隔离时,一定要比较轻地加上去,避免稀释上层的分离胶,使胶不均匀。

18. 为什么提高大分子量蛋白的转移的时候,小分子量蛋白会丢失一些哪?什么原因?
解答:小分子的蛋白在转移过程中,会透过膜去,所以大分子的上去以后,有一部分小分子的就透过去了。

19. 上次转染了1.6*106细胞,收集,收集到了400微升体积,加6*loading buffer, 95度煮5分钟,-20度,交替3次,离心,上样,7%分离胶,先80v跑进分离胶,在100v电泳至溴酚兰出胶,biorad半干转PDVF膜,15v转30分钟,预染marker全部进膜,转移后的胶考马斯亮兰染,可见残留的蛋白带,大分子量多些.blot时,封闭用5%奶粉TTBS 1小时,抗体稀释液TTBS,一抗(1:10,单抗上清,2000年制备)1小时,二抗(1:2000)1小时,均在室温.结果,50kd的小分子显色,160kd大分子未显色。
原因分析及准备改进:转染大容量的质粒(融合蛋白的质粒)的效率会相对较低,大分子量表达也会相对较低,加上大分子量蛋白的转移不完全,可能是我没有拿到大分子量条带结果的原因。另外背景稍微有一些脏(背景整体均匀一致),估计是二抗的浓度高了些,准备降至1:5000,另外抗体稀释液准备改用5%奶粉TTBS,封闭改为室温2小时。这个过程有没有问题?
解答:首先分析你的整个实验步骤。我发现了两个比较大的毛病:
a、一抗用TBST稀释。按照我的理解,一抗更好用5%的TBST脱脂牛奶稀释,和你的封闭液相一致,这样可以降低背景。
b、“biorad半干转PDVF膜,15v转30分钟”,你是这么做的吗?因为我大部分时间是做的恒流转移,用的是0.1mA/膜,100kd--200kd转2小时。到最后电压会升到20v左右。你用恒压法,我不是很肯定你转30分钟能将大分子(160kd)的抗原转上去。我建议你更好能将时间延长,如果是恒流,可按我的做法;如果是恒压,可摸索一下,适当延长时间。有时候你的marker也有可能欺骗你,因为marker的量比较大,是很容易转上去的,实际上目标蛋白的量远远少于marker量。
我对你的结果分析如下:
a、你的结果很好,估计离目标不远了,很快就可以成功。
b、 没有160kd的带是因为你的转移时间过短,适当延长转移时间(我怀疑这是主要的问题)。
c、你的一抗用1:10,2抗可以降到1:5000,背景会低一点。

 


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