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洋葱表皮细胞瞬时转化

作者:生命科学事业部时间:2019-11-25 14:15:25浏览63 次

信息摘要:

本实验在构建了OsAGAP瞬时表达载体的基础上,采用基因枪轰击洋葱表皮观察了GFP的瞬时表达。

洋葱表皮细胞瞬时转化

实验材料准备
选取新鲜、生长状况良好的洋葱,在超净工作台上除去外面的1-2层鳞片,用无菌解剖刀十字形切开洋葱球茎,取球茎内部较新鲜肥厚的鳞片(第4-7层最为理想),在内表皮(凹面)用刀片划出面积约2cm × 2cm的小方块,用无菌镊子将小方块撕下,贴近叶肉的一面朝下,平铺于含有MS培养基的培养皿内,28℃弱光下预培养4 h,然后利用基因枪法进行目的基因的转化。

金粉准备
(1) 称取60 mg金粉放入1.5 mL离心管,加入1 mL无水乙醇,涡旋振荡2 min;
(2) 冰上放置5 min后,10,000 r/min离心1 min,去上清;
(3) 按步骤1,2重复清洗金粉2次;
(4) 加入1 mL无菌水,涡旋振荡2 min,冰上放置5 min后,10,000 r/min离心1 min,去上清;
(5) 重复步骤4两次;
(6) 加入1 mL无菌水,在涡旋振荡条件下,按50 μL每份分装到1.5 mL离心管备用。

质粒DNA包埋金粉
(1) 取50 μL已分装好的金粉悬浮液,在涡旋振荡条件下依次加入5 μL质粒DNA(1 μg/μL),50 μL 2.5 mol/L CaCl2,20 μL 0.1 mol/L亚精胺;
(2) 涡旋振荡3 min,室温下,10,000 r/min离心10 sec,尽可能弃去上清;
(3) 加入50 μL无水乙醇,可进行4次基因枪轰击。

基因枪轰击操作
射击参数:轰击微粒运行距离9 cm,压力1350 psi,真空度20 mmHg。将轰击结束后的材料,继续在28℃弱光下培养8 h,然后使用LUYOR-3415RG便携式荧光蛋白激发光源照射,佩戴LUV-30A观察眼镜观察EGFP基因的表达或使用激光共聚焦显微镜在488 nm波长激发下观察EGFP基因的表达。

Onion.jpg

 

 


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