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Northern blot外源基因表达转录水平检测操作步骤

作者:生命科学事业部时间:2019-10-22 10:22:51浏览214 次

信息摘要:

蛋白质印迹的发明者是斯坦福大学 George Stark。Neal Burnette 于 1981 年所著的 Analytical Biochemistry 中被称为 Western Blot。最开始做印迹的是一个叫 Southern 的科学家,但印迹的对象是 DNA 链,他把这种技术称为  Southern blot,后来出现了两个过程相似,但是对象不同的印迹方法,一个针对RNA,一个对蛋白质,人们分别把这两种技术的称为 Northern 和 Western,与这两个技术的发明人没有关系了。

外源基因的表达需要经过转录(mRNA生成)、翻译(蛋白质合成)、修饰等过程,最后才能形成具有生物学活性的蛋白质分子,因此,对一个基因表达的检测,可以从其表达过程的不同阶段来进行。

转录水平指的是mRNA的表达水平,然后mRNA经过翻译成为目的蛋白。mRNA的检测是研究基因表达盒功能的重要,常用方法,通过mRNA的分析,可以大致估计一种基因的翻译水平,但mRNA不能代替蛋白质水平的分析,因为还有翻译效率和RNA降解速度,以及蛋白质剪切和分解速度等因素的影响。目前检测mRNA的方法包括Northern印迹(Northern blot)、逆转录-聚合链式反应(RT-PCR)、实时定量PCR(real time PCR)以及核糖核酸酶保护分析(RPA)等。

Northern_blot1.jpg

Northern印迹技术
一、原理
在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳,继而进行转膜和用探针进行杂交检测,检测样品中是否含有基因的转录产物及含量。

二、操作步骤
1、制胶
称取0.42g琼脂糖加入三角瓶中,加入DEPC水30.4ml,微波加热溶解。在通风橱中加入3.6ml的10xMOPS电泳缓冲液和1.05ml甲醛,轻轻震荡混匀,放入60度水浴中。将溶胶倒入制胶板中,插上梳子。凝固后转移如电泳槽,加1xMOPS电泳缓冲液。
2、RNA样品制备
在RNA样品中(0.5-10微克)加入10xMOPS电泳缓冲液、8.75微升甲醛、25微升甲酰胺,混匀后65度保持15min。短暂低速离心后立即放冰上5min。每份RNA样品加入10微升加样缓冲液。

3、电泳
将RNA样品加入上样孔电泳,当胶中的溴酚蓝接近胶边缘时终止电泳,在LUYOR-3410高强度紫外线灯下,用尺子测量18SRNA、28SRNA、溴酚蓝到点样孔的距离
4转膜
用3%的双氧水侵泡真空转移仪,用DEPC水冲洗。用RNAZap擦洗电极板和转移框,用DEPC水冲洗2次。连接真空泵和真空转移仪,剪取1块合适大小的转印膜,转印膜在20xssc润湿5min,放在电极板适当的位置。将胶的多余部分切除,切后胶的大小与转印膜一致。将较放在膜上,排出气泡。封闭转移框,打开真空泵压力维持在50-58mbar,立即将20xSSC加到胶面和四周,每隔10min在胶面上加1ml20xSSC,真空转移2h。转膜后,用镊子夹住膜,在1xMOPS中泡洗10s,去除残余的胶和盐。用吸水纸洗去膜上多余的液体后,将膜置于紫外交联仪中自动交联。将胶和紫外交联后的膜,于LUYOR-3410高强度紫外线灯下检测转移效率。将膜在-20度保存。

5探针的准备
(1)、在1.5ml离心管中配置以下反应液:模板DNA(25ng)1微升,随机引物2微升,灭菌水11微升,总体积14微升。
(2)95度加热3min后,迅速放置于冰上冷却5min
(3)在离心管中按照下列顺序加入溶液:10x缓冲液2.5ul,DNTP混合物2.5ul,32P-dCTP 5ul,Exo-free Klenow Fragment 1ul
(4)混匀后,37度反应30min,短暂离心,收集溶液。
(5)65度加热5min使酶失活。

6、探针的纯化及比活性测定
(1)将1g凝胶加入30ml的DEPC水中,侵泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次,以除去可溶解的葡聚糖。换用新配的TE缓冲液(PH7.6)
(2)在1ml注射器层析柱中填装Sephadex G50凝胶。
(3)将注射器放入一只15ml离心管中,注射器把手架在离心管口,1600g离心4min,凝胶压紧后,补加Sephadex G50凝胶,重复此步骤直到凝胶高度达到0.9ml。
(4)用100ul STE缓冲液洗柱,1600g离心4min。重复3次。
(5)倒掉离心管中的溶液,将一去盖的1.5ml离心管置于管中,再将装填了凝胶的注射器插入离心管,注射器口对准1.5ml离心管。
(6)将标记的DNA样品加入25ul STE
(7)1600G离心4min,DNA将流出并被收集在去盖的离心管中,而未掺入DNA的dNTP则保留在色谱柱中。
(8)测比活性(要求106cpm/ml)

7、预杂交
(1)将Northern预杂交缓冲液在杂交炉中68度预热,并涡旋使未溶解的物质溶解。
(2)加入适当 的预杂交缓冲液到杂交袋中,42度预杂交4h

8、探针变性

(1)用10mmol/L EDTA将探针稀释10倍。
(2)90度热处理稀释的探针10min后,立即放置冰上5min
(3)短暂离心,将溶液收集在管底。

9、杂交
(1)加入0.5ml杂交缓冲液到变性的探针中,混匀。
(2)从杂交袋中移出预杂交缓冲液后,将含探针的杂交缓冲液加入
(3)42度杂交过夜(14-24h)

10、洗膜
(1)1xSSC加入0.1%SDS,(100cm2膜面积加入20ml),室温下晃动洗膜15min,2次。
(2)0.25xSCC加入0.1%SDS,(100cm2膜面积加入20ml),室温下晃动洗膜15min,2次。

11曝光
(1)将膜从洗膜液中取出,用保鲜膜包住,以防干燥
(2)检查膜上放射性强度,估计曝光时间
(3)将X射线底片覆盖于膜上,曝光
(4)冲洗X射线底片,扫描结果。

 


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