美国路阳中国公司为客户提供更理想的光源!
021-64195798
153-17565658
热门关键词:B-100AP LUYOR-3415RG
您的位置:首页>>公司与行业>>公司新闻

转基因玉米荧光现场可视化检测方法

作者:上海路阳生物时间:2021-12-31 09:26:21浏览664 次

信息摘要:

近日,浙江省农业科学院发表文献,利用LUYOR-3415RG便携式荧光蛋白激发光源对转基因玉米双抗的可视化检测。文献摘要如下:    本研究建立的现场可视化检测方法与 qPCR 方法检测结果一致,并且可视化检测方法时间短, 检测结果清晰易分辨。本研究建立的转基因玉米双抗 12-5 现场快速可视化检测方法,其特异性强、灵 敏度高、方便、快捷,不仅满足了转基因玉米双抗 12-5 的现场快速检测的需要,也为其他现场快速检 测方法的开发提供了新思路。

近日,浙江省农业科学院发表文献,利用LUYOR-3415RG便携式荧光蛋白激发光源转基因玉米双抗的可视化检测。文献摘要如下:

转基因玉米双抗 12-5 具有良好的抗虫性和除草剂耐受性,是我国批获得安全证书的转基因 玉米之一,具有广阔的应用前景。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)建立转基因玉米双抗 12-5 的现场快速检测方法。

针对转基因玉米双抗 12-5 的转 化体特异性序列片段,设计引物和探针,通过引物筛选实验得到更佳引物与探针组合。荧光 RPA 扩增 结果可以在蓝光(LUYOR-3415RG)下直接进行可视化分析。结果表明,建立的转基因玉米双抗 12-5 可视化检测体系特异 性强,检测灵敏度达到 10 拷贝。进一步研究发现 RPA 的扩增体系对温度有很强的适应性,样品在 34℃ ~46℃之间都能得到扩增,据此,本研究利用市面上常见的自发热暖贴代替常规的加热仪器来激发 RPA。 结果表明,自发热暖贴满足 RPA 扩增体系对温度的需要。

最终,本研究将自发热暖贴加热法与 RPA 可 视化检测体系结合,对转基因玉米双抗 12-5 进行现场检测,并与 qPCR 方法检测结果作比较,检测结果表明,本研究建立的现场可视化检测方法与 qPCR 方法检测结果一致,并且可视化检测方法时间短, 检测结果清晰易分辨。本研究建立的转基因玉米双抗 12-5 现场快速可视化检测方法,其特异性强、灵敏度高、方便、快捷,不仅满足了转基因玉米双抗 12-5的现场快速检测的需要,也为其他现场快速检测方法的开发提供了新思路。

QQ图片20211231093721s.png


1 材料与方法 

1.1 材料 转基因玉米双抗 12-5 种子,转基因玉米 NK603、BT176、T25 和 BT11,转基因大豆 A5547-127、356043、GTS40-3-2 和 FG72,转基因油菜 MS1×RF1、MS2×RF2、MS8×RF3 和 OXY235,转基因棉花 LLcotton25、MON15985 和 GHB119 的 DNA 均来自本实验室。 

1.2 DNA 提取 按照植物 DNA 提取试剂盒(杭州新景生物试剂开发有限公司)说明书提取各样品的基 因组 DNA,所提取的 DNA 用核酸蛋白测定仪 NanoDrop2000C(美国 Thermo 公司)进行核 酸质量分析,并置于-20℃贮存备用。 

1.3 荧光 RPA 参照 RPA(荧光型)试剂盒(潍坊安普未来生物科技有限公司)说明书进行体系配置, 荧光 RPA 反应体系为 50 μL:Buffer A 12.5 μL,10 μmol/L 正、反向引物各 2 μL,10 μmol/L 探针 0.6 μL,模板 DNA 2 μL,加 ddH2O 补齐到 47.5 μL,充分混匀后加入 Buffer B 2.5 μL, 再次混匀。荧光 RPA 反应条件:39℃扩增 20 min。荧光 RPA 的实时荧光信号用荧光定量 PCR 仪 CFX96(美国伯乐公司)观察,荧光 RPA 的可视化结果用手持蓝光灯(LUYOR-3415RG,路阳仪器)照射并在黄色滤镜下拍照观察。 

1.4 引物与探针设计 荧光 RPA 体系包括 2 条引物和 1 条探针,转基因玉米双抗 12-5 的载体示意图及扩增的 转化体特异性序列信息见图 1A。利用 Vector NTI 软件在外源插入位点的左侧即转基因玉米 基因组序列设计上游引物 8 条,在外源插入位点的右侧即外源插入片段序列设计下游引物 8 条。所设计的上、下游引物分别处于外源插入位点的两侧,以保证对转基因玉米双抗 12-5 的 特异性扩增。引物长度 30~35 bp,GC 含量占 30%~70%[13]。所设计探针包含玉米基因组和 外源片段的序列,长度 46~52 bp,并避免回文序列、内部二级结构和连续重复碱基。探针共 有 4 个修饰位点,在距离 5'端中间部位,第 31 个碱基 G 处标记一个四氢呋喃(THF)碱基 类似物,作为核酸外切酶的识别位点;在 THF 位点的上游,第 30 个碱基 T 处标记一个荧光 基团(FAM:6-羧基荧光素),在 THF 位点的下游,第 33 个碱基 T 处标记一个淬灭基团(BHQ: 荧光猝灭基团),两基团的间距为 1~5 bp;THF 位点距离 3'末端至少 15 bp 长度,并在 3'末 端标记一个修饰基团。只有当探针与序列成功配对时,THF 位点才会被外切酶切割,使荧光 基团与淬灭基团分离,从而产生荧光信号(图 1B)。 转基因玉米双抗 12-5 的普通 PCR 引物和 qPCR 引物引用标准[14],本研究所用的引 物和探针配制为 10 μmol/L。所有引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成, 引物和探针信息见表 1。 

1.5 引物筛查 用上游引物 F1 分别与所有下游引物组合,结合探针,对转基因玉米双抗 12-5 进行实时 荧光 RPA 检测实验,分析结果,选出其中扩增效率更高的下游引物,再用这条下游引物分 别与所有上游引物组合,结合探针,对转基因玉米双抗 12-5 进行实时荧光 RPA 检测实验, 选择扩增效率更高的一组,作为最终的检测引物组合。

QQ图片20211231093939.png

RRC平台实样现场检测

为评估RRC平台在真实样品现场检测中的适用性,以96颗大豆的96片叶片作为真实样品。一个简短的工作流程展示在图 3A. 所有 DNA 均通过 RDEM 提取,并用作 RT-PCR 和 RAA 的模板。RRC平台的视觉荧光结果表明,从96个样品中检测到22个SHZD32-1。带有SHZD32-1的试管中呈现亮绿色荧光。因此很容易与其他没有 SHZD32-1 的管区分开来(图 1B)。此外,使用荧光成像系统(ChemiDoc Imaging System,Bio-Rad,美国)分析 RRC 平台的 96 孔板。在这些管中观察到白色荧光(图 1B)。这一结果意味着手持荧光灯(LUYOR-3415RG)的可视化结果可以与大型专业仪器的观察结果相媲美。此外,RRC平台和RT-PCR的现场检测结果一致。96份样本经RT-PCR检测,同样22份样本为SHZD32-1,22份样本的Ct值与扩增曲线一起给出(图 1C)。这些发现表明,RRC 平台对于目标核酸的现场检测具有高度的准确性。

文献全文下载地址:

Frontiers | A Fast, Visual, and Instrument-free Platform Involving Rapid DNA Extraction, Chemical Heating, and Recombinase Aided Amplification for On-Site Nucleic Acid Detection | Bioengineering and Biotechnology (frontiersin.org)

LUYOR-3415RG便携式荧光蛋白激发光源产品介绍:

https://www.luyoruv.com/jifaguangyuan/LUYOR-3415RG.html 

1573530098248906.jpg


【转基因玉米荧光现场可视化检测方法】链接地址:https://www.luyoruv.com/news/news1/648.html
未经公司同意,严禁转载我站文章,经同意转载的,必须注明出处。
返回列表 本文标签: