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分子生物学

作者:生命科学事业部时间:2019-12-14 20:12:40浏览91 次

信息摘要:

在大多数核酸杂交反应中,经过凝胶电泳 分离的DNA或RNA分子,都是在杂交之前,通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地"吸印" 转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜,叠氮苯氧甲基纤维素滤纸(DBM)和二乙氨基乙基纤维素滤膜(DEAE)等。

分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学,是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘,由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。当人们意识到同一生物不同世代之间的连续性是由生物体自身所携带的遗传物质所决定的,科学家为揭示这些遗传密码所进行的努力就成为人类征服自然的一部分,而以生物大分子为研究对像的分子生物学就迅速成为现代社会中更具活力的科学。
 从1847年Schleiden和Schwann提出"细胞学说",证明动、植物都是由细胞组成的到今天,虽然不过短短一百多年时间,我们对生物大分子--细胞的化学组成却有了深刻的认识。孟德尔的遗传学规律更先使人们对性状遗传产生了理性认识,而Morgan的基因学说则进一步将"性状"与"基因"相耦联,成为分子遗传学的奠基石。Watson和Crick所提出的脱氧核糖酸双螺旋模型,为充分揭示遗传信息的传递规律铺平了道路。在蛋白质化学方面,继Sumner在1936年证实酶是蛋白质之后,Sanger利用纸电泳及层析技术于1953年阐明胰岛素的一级结构,开创了蛋白质序列分析的先河。而Kendrew和Perutz利用X射线衍射技术解析了肌红蛋白(myoglobin)及血红蛋白(hemoglobin)的三维结构,论证了这些蛋白质在输送分子氧过程中的特殊作用,成为研究生物大分子空间立体构型的先驱。

DNA重组技术(又称基因工程)
这是20世纪70年代初兴起的技术科学,目的是将不同DNA片段(如某个基因或基因的一部分)按照人们的设计定向连接起来,在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达,产生影响受体细胞的新的遗传性状。严格地说,DNA重组技术并不完全等于基因工程,因为后者还包括其他可能使生物细胞基因组结构得到改造的体系。DNA重组技术是核酸化学、蛋白质化学、酶工程及微生物学、遗传学、细胞学长期深入研究的结晶,而限制性内切酶DNA连接酶及其他工具酶的发现与应用则是这一技术得以建立的关键。
DNA重组技术有着广阔的应用前景:DNA重组技术可用于定向改造某些生物基因组结构,使它们所具备的特殊经济价值或功能得以成百 上千倍的地提高。DNA重组技术还被用来进行基础研究。如果说,分子生物学研究的核心是遗传信息的传递和控制,那么根据中心法则,我们要研究的就是从DNA到RNA,再到蛋白质的全过程,也即基因的表达与调控。在这里,无论是对启动子的研究(包括调控元件或称顺式作用元件),还是对转录因子的克隆及分析,都离不开重组DNA技术的应用。

基因表达调控研究
因为蛋白质分子参与并控制了细胞的一切代谢活动,而决定蛋白质结构和合成时序的信息都由核酸(主要是脱氧核糖核酸)分子编码,表现为特定的核苷酸序列,所以基因表达实质上就是遗传信息的转录和翻译。在个体生长发育过程中生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化(时序调节),并随着内外环境的变化而不断加以修正(环境调控)。
原核生物的基因组和染色体结构都比真核生物简单,转录和翻译在同一时间和空间内发生,基因表达的调控主要发生在转录水平。真核生物有细胞核结构,转录和翻译过程在时间和空间上都被分隔开,且在转录和翻译后都有复杂的信息加工过程,其基因表达的调控可以发生在各种不同的水平上。基因表达调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑3个方面。转录因子是一群能与基因5’端上游特定序列专一结合,从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。
  真核基因在结构上的不连续性是近10年来生物学上的重大发现之一。当基因转录成pre-mRNA后,除了在5’端加帽及3’端加多聚A[polyA]之外,还要将隔开各个相邻编码区的内含子剪去,使外显子(编码区)相连后成为成熟mRNA。研究发现,有许多基因不是将它们的内含子全部剪去,而是在不同的细胞或不同的发育阶段有选择地剪接其中部分内含子,因此生成不同的mRNA及蛋白质分子。

结构分子生物学
生物大分子的结构功能研究(又称结构分子生物学) 一个生物大分子,无论是核酸、蛋白质或多糖,在发挥生物学功能时,必须具备两个前提:首先,它拥有特定的空间结构(三维结构);其次,在它发挥生物学功能的过程中必定存在着结构和构象的变化。结构分子生物学就是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。它包括结构的测定、结构运动变化规律的探索及结构与功能相互关系的建立3个主要研究方向。最常见的研究三维结构及其运动规律的手段是X射线衍射的晶体学(又称蛋白质晶体学),其次是用二维核磁共振和多维核磁研究液相结构,也有人用电镜三维重组、电子衍射、中子衍射和各种频谱学方法研究生物高分子的空间结构。


分子生物学研究法

一、重组DNA技术发展史上的重大事件
1.40年代确定了遗传信息的携带者,即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质,解决了遗传的物质基础问题;
2.50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题;
3.50年代末至60年代,相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地破译了遗传密码,充分认识了遗传信息的流动和表达。
重组DNA技术历史上的主要事件
年份  事 件
1869  F Miescher从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。
1944 O.T. Avery证实DNA是遗传物质。
1952 A.D. Hershey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。
1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。
1957  A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。
1958  M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留复制模型。
1959-1960  S. Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA,并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。
1961 Nirenberg破译了相遗传密码;F. Jacob和J. Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。
1964  C. Yanofsky和S. Brenner等人证明,多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。
1965  S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定;科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。
1966  M.W.Nirenberg,S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。
1970 H.O.Smith,K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。
1972-1973  H.Boyer,P.Berg等人发展了DNA重组技术,于72年获得个重组DNA分子,73年完成例细菌基因克隆。
1975-1977  F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。
1978  在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。
1980 美国联邦更高法院裁定微生物基因工程可以化。
1981 R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠;A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。
1982 美、英批准使用例基因工程药物--胰岛素;Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。
1983  获得例转基因植物。
1984  斯坦福大学获得关于重组DNA的。
1986  GMO在环境中释放。
1988  J. D. Watson出任"人类基因组计划"首席科学家。
1989 DuPont公司获得转肿瘤基因小氧--"Oncomouse"。
1992  欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb)
1994 批基因工程西红柿在美国上市。
1996 完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。
1997 英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。
基因工程中常见的名词:
遗传工程--genetic engineering,基因操作--gone manipulation,基因克隆--gone cloning,
重组DNA技术--recombinant DNA technology,分子克隆--molecular cloning。

基因工程的主要内容或步骤:
1. 从生物有机体基因组中,分离出带有目的基因的DNA片段。
2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上,形成重组DNA分子。
3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主细胞)并与之一起增殖。
4. 从大量的细胞繁殖群体中,筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞,并筛选出已经得到扩增的目的基因。
5. 将目的基因克隆到表达载体上,导入寄主细胞,使之在新的遗传背景下实现功能表达,产生出人类所需要的物质。

基因操作的主要技术原理
1.核酸的凝胶电泳(Agarose & Polyacrylamide)
将某种分子放到特定的电场中,它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率,它与电场强度成正比,与该分子所携带的净电荷数成正比,而与分子的磨擦系数成反比(分子大小、极性、介质的粘度系数等)。在生理条件下,核酸分子中的磷酸基团是离子化的,所以,DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态(Polyanions)。将DNA、RNA放到电场中,它就会由负极→正极移动。 在凝胶电泳中,一般加入溴化乙锭(EB)--ethidium bromide染色,此时,核酸分子在紫外光下发出荧光,肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。

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2.核酸的分子杂交技术
在大多数核酸杂交反应中,经过凝胶电泳 分离的DNA或RNA分子,都是在杂交之前,通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地"吸印" 转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜,叠氮苯氧甲基纤维素滤纸(DBM)和二乙氨基乙基纤维素滤膜(DEAE)等。
核酸分子杂交实验包括如下两个步骤:
将核酸样品转移到固体支持物滤膜上,这个过程特称为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移,主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting);
将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。

3.细菌的转化
所谓细菌转化,是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA,而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株,而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前,必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞,使之呈感受态(Competent Cells)。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用,质粒DNA中的抗生素是筛选标记。
对绝大多数hsdR-,hsdM-突变体菌株(k12),每ug DNA可得107-108个转化子

三、分子克隆技术

1、高质量mRNA的制备
   应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育,加入与微磁球相连的Streptavidin,用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。
2.反转录成cDNA
可同时在反转录系统中加入Oligo(dT)12-18-mer及随机引物R6,以保证得到全长cDNA;
应选用活性较高的反转录酶(Reverse transcriptase);
应选用甲基化dCTP;
应保证所获得双链cDNA的方向性。

四、DNA的Microarray
只要事先除去高度及中等重复序列,任何DNA都可以被用于Microarray。最简单的例子是用机械手把极微量(nanoliters)的DNA点到玻片或其它载体上,照射UV light使之固定,用不同细胞周期发育阶段的cDNA作探针系统性地研究细胞中任意时期特异表达的基因;若把某一生物体内全部全部已知基因分别点到DNA微列阵或者基因芯片上,再用不同发育阶段的cDNA与之杂交,就能了解某些基因对特定生长发育阶段的重要性;基因芯片还可用于进行基因诊断,可建立正常人特定组织、器官的基因芯片,给出标准杂交信号图。用可疑病人的cDNA做探针与之杂交,检查哪些基因的表达受抑制或激活。

 


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