模式生物--小鼠

小鼠属脊椎动物门，哺乳纲，啮齿目，鼠科，小鼠属动物。小鼠的世代短，成熟早，繁殖很强，属全年、多发情动物，一年可产仔胎数6－10胎，每胎产仔数8－15只，且具有体型小、易于管理等特点。在进化上，小鼠与人类的距离较近，约有1亿年。其解剖学结构、发育过程、生化代谢途径都与人接近，为人类疾病的克隆提供了的实验材料。作为经典的医学实验动物，小鼠已经对医学诸多领域的研究作出了卓越贡献。

大约6000万年前，鼠属出现在地球上，经过漫长的繁殖和进化，出现诸多分支，比如褐家鼠、仓鼠、田鼠等。直至19世纪，宠物爱好者开始选择性的饲养和驯化家鼠，从而逐渐出现了一些具有各种可爱颜色皮毛的宠物鼠。1897年，生物学家William Haacke 发现白鼠和杂色鼠杂交会产生重组表型。他观察到代宠物鼠全部是杂色，但是到了第二代就出现了重组表型：既有白色鼠又有杂色鼠。William Haacke观察到的现象实际上已经触及了孟德尔遗传定律，但由于没有严谨的实验数据，使得他的报告受到了一些争议，这项重要的工作最终也被忽视了。20世纪初，科学家们开始用这些不同颜色的宠物鼠进行一些遗传学实验，因此这些宠物鼠成了实验鼠的“先驱”。

比如1902年，哈佛大学的William Ernest Castle通过观察的宠物鼠毛色，以验证孟德尔遗传定律的正确性。1905年，法国遗传学家Lucien Claude Cuéno对黄白相间的杂色鼠进行研究发现两个携带黄色皮毛基因的宠物鼠之间交配，其子代宠物鼠中黄色宠物鼠和白色宠物鼠的数量比总是2:1。Cuénot据此认为，黄色基因对白色基因来说是显性的。但是这个数据似乎孟德尔遗传定律有所出入，因为按照孟德尔遗传定律，黄鼠与白鼠数量之比应当是3:1，另外那部分黄色宠物鼠究竟哪去了呢？后来，Castle 和 Little经过研究才终于发现，原来那些“失踪”了的宠物鼠在还未出生就死掉了，这意味着，携带两个黄色基因对宠物鼠来说是致死性的！同时，这也是所报道的个等位纯合致死基因。1909年，哈佛大学生物学家Clarence Cook Little，培育出了个现代实验鼠株系――DBA直到今天它仍然是遗传学实验室中的重要实验材料。

1921年，Clarence Cook Little又将从Abbie Lathrop的农场里买回来的一只编号为57的雌性小鼠的后代培育成了的C57BL的小鼠株系，成为使用最广泛，最重要的小鼠株系之一。1929年， Hudson在汽车公司的巨头Edsel Ford和Roscoe Jackson两位大财阀的资助下，Charence Cook Little 在美国的缅因州Bar Harbor 建立了Jackson 实验室。该实验室随后成了世界上最重要的宠物鼠遗传学研究中心之一。

近交系小鼠的建立极大推动了以小鼠为模型的科学研究，目前已建立的品系有近千种之多，常用的近交系小鼠也有50个品系之多。随着克隆技术、转基因技术、测序技术等生命科学技术的发展，小鼠的基因背景越来越清晰，加之在进化地位上与人类的距离非常近，解剖学结构、发育过程、生化代谢途径都与人接近，又由于人类对自身理解的限制、实验的限制和伦理学的制约，因此小鼠就成为在医学、生物学等诸多领域的研究中重要的模式生物。

那么小鼠为什么能成为更好的模式动物呢？这主要取决于以下四方面；
1、小鼠的基因组计划已基本完成。基因组序列的大量信息为研究基因功能及其表达调控、胚胎发育和人类疾病的分子机制提供了条件基础和技术手段；
2、小鼠生理生化和发育过程和人类相似，基因组和人类98%同源，所以很多小鼠疾病模型可以基本上真实的模拟人类疾病的发病过程及对药物的反应；
3、小鼠的基因改造技术成熟；从上世纪七八十年代基因改造技术诞生以来到最新的技术突破，基因改造技术在小鼠模型构建方面日趋完善。美国科学家MarioR.Capecchi、OliverSmithies和英国科学家MartinJ.Evans因“涉及使用胚胎干细胞进行小鼠特定基因修饰方面的一系列突破性发 现” 而获得2007年度诺贝尔生理学或医学奖。
4、小鼠繁殖能力强，性成熟早，体型小巧且易于管理，用于实验更加方便快捷。

目前，制备基因敲除的模式动物多采用基于胚胎干细胞的同源重组技术、CRISPR/Cas9技术及TALEN技术，百奥赛图在ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技术的基础上，开发并优化出一套的基因敲除/敲入系统（Biocytogen Extreme Genome Editing System）简称EGE系统。EGE系统比普通CRISPR/Cas9技术介导的同源重组效率提高了10-20倍，使得基因改造更加快速和方便。目前，CRISPR/Cas9技术制备基因敲除模式动物小鼠最快需4个月，既传统又稳定的基于胚胎干细胞的同源重组技术现在最快也需7个月，而利用百奥赛图EGE系统最快2个月即可得到基因敲除的模式动物小鼠。这一速度的突破有力的巩固了小鼠在模式动物界的地位，为我国的科研事业奠定了稳固的基础，让生命科学研究又向前迈进了一大步。

在生物医药行业，鼠是最常用的模式动物。特别是，近年来，随着基因编辑技术的飞速发展，利用基因修饰的大小鼠进行人类疾病的前沿研究也取得了重大的成果。利用基因修饰小鼠作为人类疾病模型，一方面推动了对人类疾病分子机制和细胞信号转导的了解；此外，基因编辑技术的小鼠模型也为绘制个体病理基因表达谱提供了重要科研数据，这为今后的个体精准医疗奠定了重要基础。

首期介绍过的ES细胞基因打靶技术是获取基因编辑小鼠的传统方法，这一技术起源于上世纪80年代，1984年Bradly等实现了ES细胞以当时相对较高的概率发育为嵌合体小鼠的生殖细胞系。 1987年，Thompsson等利用ES细胞技术建立了次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)基因敲除的小鼠模型，此后这项技术获得了长足发展。然而，利用ES细胞基因打靶技术建立小鼠模型因操作繁琐复杂、耗时长、人力物力成本高，限制了这一技术的广泛应用。但是，ZFN、TALEN以及CRISPR/Cas9等新兴基因编辑技术的出现和发展颠覆了遗传工程动物模型的构建方式，甚至有可能重新定义哪些物种可作为模式生物。尤其是利用最新的CRISPR技术科学家现在可以在短短3-4周的时间内构建出携带单个甚至多个基因突变的小鼠，而采用传统的方法这需要数年的时间。并且CRISPR/Cas9具有操作简便，靶点选择范围广，作用活性高等优势。

CRISPR/Cas9做为目前效率更好的基因编辑工具之一，我们这次就先来说说以利用CRISPR-Cas9是如何建立基因编辑小鼠模型的

实验步骤
1.针对特定基因序列，利用软件（sgRNA Designer）预测潜在sgRNA序列，并依据实验要求挑选合适的靶点；
2.sgRNA活性筛选，选出有活性且特异性高的sgRNA；
3.构建sgRNA表达载体，并利用T7体外转录试剂盒进行sgRNA体外转录；
4.利用SP6转录试剂盒进行Cas9  mRNA体外转录；
5.将Cas9 mRNA和sgRNA按合适浓度混匀，并进行受精卵显微注射；
6.注射后的受精卵移植到假孕母鼠体内继续发育；
7.待子代小鼠出生后对其进行基因型分析。

sgRNA设计与筛选
1.选择sgRNA靶点时应挑选特异性高的序列，以避免off-target效应；
2.将sgRNA oligo构建至px330载体上，同时构建含有目的基因靶序列的luciferase 表达载体上，二者共同转染293T细胞；
3.转染6小时后补液，48小时后收集细胞，并加入裂解液裂解细胞；
4.12,,000rpm离心5min，将上清液收集至洁净EP管中；
5.按荧光素酶试剂盒进行操作并检测。

F0代小鼠基因型鉴定
1.取出生后5—7天小鼠组织，消化并提取基因组后进行PCR，扩增目的条带；
2.将PCR产物进行梯度降温退火处理，加T7E1酶并在37℃水浴酶切30min；
3.琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物是否能被切割为多条片段；
4.送测序分析，并保留符合要求的突变小鼠；
5.待小鼠具有生殖能力后进行交配，以获得足够数量的杂合及纯合小鼠。

注意事项：
1.体外转录的Cas9 mRNA和sgRNA要求纯度高，且在操作过程中防止RNA降解；
2.显微注射胚胎要保证状态良好，且数量充足；
作为协助及提供科研解决方案的生命科学实验室，邦耀实验室基于基因编辑技术平台，已经成熟掌握利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除、基因敲入及条件性敲除的大小鼠，可以靶向的构建模式动物。