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Northern Blot实验操作步骤

作者:生命科学事业部时间:2019-11-10 09:17:02浏览235 次

信息摘要:

Northern blot一个主要的问题是存在RNA酶的污染,所以Northern blot中所有的实验用品都需要经过除去RNA酶的过程,如NaOH浸泡处理、DEPC处理等。抽提的RNA质量一定要好,这是实验结果好坏的关键,更好浓度比较一致,杂质较少。有条件的话可以先电泳检测。Norther blot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等对人体都有一定的伤害,要注意保护。

实验原理:
在变性条件下将待检RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳,使其按照分子量大小分离。按照同Southern Blot相同的原理进行转膜,并使用探针进行杂交检测。相比RT-PCR等技术,Northern blot具有稳定、可靠、假阳性少等优点。

实验目的:
检测样品中某一特定基因mRNA的转录与否,以及转录的水平。比较两个或两个以上的不同样品中某一基因的转录差异

材料与试剂

进口RNAase free 1.5 ml和0.5 ml管子*
进口RNAase free 20 μl、200 μl枪头*
转膜盘子
玻璃棒
玻璃板
胶片
滤纸
洗膜盒
DEPC水*
*注:需经高温高压灭菌处理。

Random Primer DNA Labeling Kit Ver 2.0 (TAKARA, catalog number: D6045)
琼脂糖
NaAc
NaOH (国药试剂)
EDTA (国药试剂)
MOPS (上海生工)
NaH2PO4 (国药试剂)
H3PO4 (85%,国药试剂)
NaCl (国药试剂)
Na3Citrate (柠檬酸三钠,国药试剂)
SDS (国药试剂)
Deionized formamide (上海生工)
37% formaldehyde (甲醛,国产)
Glycerol (国产)
Bromphenol Blue (溴酚蓝,Sigma)
Xylene Cyanol (二甲苯氰,Sigma)
1 M NaAc (pH 7.0) (见溶液配方)
4 N NaOH (见溶液配方)
0.5 M EDTA (pH 8.0) (见溶液配方)
10x MOPS buffer (见溶液配方)
1 M NaH2PO4 buffer (pH 7.2) (见溶液配方)
20x SSC (见溶液配方)
10% SDS (见溶液配方)
Sample buffer (见溶液配方)
转膜缓冲液 (见溶液配方)
Blue juice (loading buffer) (见溶液配方)
Hibridization buffer (见溶液配方)
洗膜液 (见溶液配方)
4x SSC (见溶液配方)

Northern_blot1.jpg

仪器设备

烧杯
量筒
梳子
烧瓶
灭菌锅
电泳槽
电泳仪
离心机

水浴锅
通风橱
超净工作台
摇床
-20 °C冰箱
紫外交联仪
FLA-5100型荧光/化学发光及同位素影像扫描分析仪

实验步骤

一、转膜前预处理

先用稀释好的0.4 N NaOH将转膜需要用到的器皿浸泡过夜 (盘子、玻璃棒、玻璃板、烧杯、量筒、胶片、跑胶用的梳子、挡板、胶槽和制胶用的烧瓶),然后用DEPC水清洗2~3遍,晾干待用。

二、跑胶及转膜

先将100 ml 10x MOPS用灭菌的DEPC水稀释至1x MOPS (1 L),取75 ml 1x MOPS (中号电泳槽半板) 制备1%~1.2%浓度琼脂糖胶。琼脂糖加热融化后,冷却至70 °C加37%甲醛,使终浓度为2% (75 ml中加4.3 ml甲醛),通风橱中放1 h。剩余的1x MOPS buffer 倒入中号槽,用作电泳缓冲液。
抽提质量完好的样品RNA测好浓度后按以下体系加样:
15 μg RNA+灭菌的DEPC水 10 μl
Sample buffer 8 μl
loading buffer 2 μl
EB (10 mg/ml) 0.03 μl
加样时候,先加好RNA和DEPC水,离心机短暂离心。将Sample buffer、loading buffer和EB 按照比例配成mixture,然后向每个样品中各加10 μl。加好后,离心,65 °C水浴变性10 min,立即放冰上,点样前再用离心机甩一下。

将胶放入加好电泳缓冲液的中号槽中,预电泳5 min。按顺序点样,不要漏出,记好样品顺序。
在中号槽中,用100 V电压电泳1 h,直至最前方的蓝色染料距离点样孔约3.5~4 cm。将电泳好的凝胶在凝胶成像系统中照相,观察RNA质量及凝胶电泳情况,此时应该在成像中看到RNA无降解,并且28S和18S刚好分开。这一步拍摄的图像用于结果分析中对于样品RNA上样量和完整性进行描述。
在500 ml 4x SSC中加27 ml 37%甲醛(终浓度为2%)溶液,混匀用作转膜缓冲液(转膜缓冲液见溶液配方)。转膜具体步骤同Southern (参见“Southern Blot”吴昊等,2018),不同的是所用的转膜盘子,玻璃板,玻璃棒等都是要用预先DEPC水处理好的。一切操作要在通风橱内进行,以避免甲醛对人体的伤害。

三、杂交 

将凝胶及膜取下,分别在凝胶成像系统中观察凝胶上是否有RNA残留,膜上RNA效果是否完好。(可选内容:用紫外凝胶成像系统将膜中RNA拍摄下来,用作内参对照。也可以在杂交后,将探针洗去,用18S RNA探针再杂交一次,结果作为内参对照)。
将膜放在稀释好的2x SSC中稍漂洗,然后放在干净的滤纸上,在超净工作台上将水分吹干。于紫外交联仪内以1200 ENERGY照一次30 sec,重复一次。在超净工作台上吹5-10分钟。
在杂交管内加入约20~50 ml杂交液(依膜的数量及膜大小而定),将膜卷起放入,注意有RNA的一面朝内,于64 C杂交炉中预杂交1~4 h,注意杂交管要平衡好。(也可以用杂交袋,加入杂交液后,注意不能有气泡。后面步骤中加完探针后也要消除气泡)。
使用“Random Primer DNA Labeling Kit”进行同位素标记探针。将探针模版(PCR扩增的基因特异片段或基因的酶切片段,经回收)测好浓度后,按以下体系加入:
DNA 3 μl (10 ng~1 μg)
Random primer 2 μl
ddH2O up to 14 μl
dNTP Mixture (不含dCTP ) 2.5 μl
10x Buffer 2.5 μl
Klenow Fragment 1 μl
α-dCTP*(同位素室中加) 5 μl
先加入DNA、random primer和ddH2O,95 °C变性3~5 min,冰上放5 min。短暂离心后,继续加入dNTP和10x Buffer,离心后再加Klenow Fragment酶,加酶时注意低温操作,先加在管壁上。立即到同位素室加入同位素,混匀离心,于37 °C反应30 min。
向探针标记的离心管中加入500 μl杂交液,不盖盖子,放于干浴上,95 °C加热10 min。迅速放于冰中,冷却5 min。取出杂交管,将标记产物加入杂交管,盖紧管盖,于64 °C杂交过夜。
注:所有废物等需按照同位素室的相关规定放入指定容器!

四、洗膜,压片
将杂交管中杂交液倒出,放入指定回收器皿中。取出杂交膜,放入洗膜盒,先用少量洗膜液,冷洗10 min。将膜取出测信号,根据信号大小决定是否热洗。若信号高,换新的洗膜液,放至64 °C摇床上摇(注意转速要调低,盒子要加盖)。中间取出膜检测信号,直到信号值达到适宜为止。当膜上某一区域信号强,而其他区域信号弱代表杂交上了。然后包膜压片,压磷屏,依信号强弱决定时间。也可以压X光片,放于-20 °C 3天左右即可冲洗。

五、结果扫描
在FLA-5100扫描仪中,扫描磷屏。结果扫描完后,将磷屏消磁,杂交膜保存于暗夹中。如果是压X光片,在暗室进行显影和定影。X光片晾干后,用扫描仪将结果保存下来。

六、结果整理
将FLA-5100扫描的结果或X光片扫描结果整理,作成图片,和电泳后的RNA检测结果整合在一起,分析各样品中基因的表达情况。

溶液配方

1 M NaAc (pH 7.0)
82 g NaAc先加一定量灭菌的ddH2O
NaOH调pH值至7.0
灭菌的ddH2O定容至1 L


4 N NaOH
160 g NaOH (国药试剂)
加水至1 L溶解


0.5 M EDTA (pH 8.0)
186.1 g EDTA (国药试剂) 先加一定量灭菌的ddH2O
NaOH调pH值至8.0
灭菌的ddH2O定容至1 L


10x MOPS buffer
MOPS (上海生工) 41.85 g
1 M NaAc (pH 7.0) 50 ml
0.5 M EDTA (pH 8.0) 20 ml
加一定量未灭菌的DEPC水
4 N NaOH调pH至7.0 (约加7 ml)
未灭菌的DEPC水定容至1 L,灭菌


1 M NaH2PO4 buffer (pH 7.2)
NaH2PO4 (国药试剂) 71 g
H3PO4 (85%) (国药试剂) 4 ml
用灭菌的DEPC水定容至1 L


20x SSC
NaCl (国药试剂) 175.3 g
Na3Citrate (柠檬酸三钠 国药试剂) 88.2 g
用灭菌的ddH2O定容至1 L


10% SDS
SDS (国药试剂) 100.0 g
灭菌的ddH2O定容至1 L (将水加热到68 °C有助于溶解)


Sample buffer
Deionized formamide (上海生工) 1,000 μl
10x MOPS buffer 200 μl
37% formaldehyde(甲醛) (国产) 320 μl


转膜缓冲液
500 ml 4x SSC和27 ml 37%甲醛(终浓度为2%)溶液,混匀


Blue juice (loading buffer)
Glycerol (国产) 70 ml
5x TBE 10 ml
10% SDS 2 ml
0.5 M EDTA (pH 8.0) 4 ml
Bromphenol Blue (溴酚蓝,Sigma) 0.5 g
Xylene Cyanol (二甲苯氰,Sigma) 0.5 g
加灭菌的ddH2O定容至100 ml
37 °C摇动混匀过夜


Hibridization buffer
1 M NaH2PO4 buffer 500 ml
0.5 M EDTA (pH 8.0) 2 ml
10% SDS 700 ml
BSA 10 g
用灭菌的DEPC水定容至1 L


洗膜液
20x SSC 100 ml
10% SDS 10 ml
用灭菌的DEPC水定容至1 L


4x SSC
20x SSC 200 ml
灭菌的DEPC水定容至1 L


注意事项

Northern blot一个主要的问题是存在RNA酶的污染,所以Northern blot中所有的实验用品都需要经过除去RNA酶的过程,如NaOH浸泡处理、DEPC处理等。
抽提的RNA质量一定要好,这是实验结果好坏的关键,更好浓度比较一致,杂质较少。有条件的话可以先电泳检测。
Norther blot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等对人体都有一定的伤害,要注意保护。
实验所用的标记试剂盒为TAKARA公司的Random Primer Labeling Kit,模板DNA的长度一般不要低于300 bp。



 


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