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大肠杆菌的应用和大肠杆菌的转化步骤

作者:生命科学事业部时间:2019-11-02 13:06:59浏览163 次

信息摘要:

大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli) 革兰氏阴性短杆菌,大小0.5×1~3微米。周生鞭毛,能运动,无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气,是人和动物肠道中的正常栖居菌,婴儿出生后即随哺乳进入肠道,与人终身相伴,几乎占粪便干重的1/3。规定,每毫升饮用水中的菌落总数小于100,每100毫升水中不得检出总大肠菌群。

大肠杆菌的应用与菌株分类
大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli) 革兰氏阴性短杆菌,大小0.5×1~3微米。周生鞭毛,能运动,无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气,是人和动物肠道中的正常栖居菌,婴儿出生后即随哺乳进入肠道,与人终身相伴,几乎占粪便干重的1/3。规定,每毫升饮用水中的菌落总数小于100,每100毫升水中不得检出总大肠菌群。下面就让小编带你了解一下大肠杆菌在生物技术中的应用以及其分类。
大肠杆菌在生物技术中的应用:
作为外源基因表达的宿主,大肠杆菌具有清晰的遗传背景,简便的技术操作步骤,简单的培养条件,能够进行大规模发酵,是目前最成功,得到最广泛应用的表达体系,常常被作物高效表达的体系,倍受遗传工程专家的重视。它的基因组DNA是拟核中的一个环状分子,能够同时有多个环状质粒DNA。大肠杆菌细胞的拟核有1个DNA分子,大约有4700000个碱基对那么长,大概有4400个基因分布在DNA分子上,每个基因平均大概有1000个碱基对那么长。
除了少数几个例外,在DNA重组实验中所用的菌株以及分子生物学中常用的大肠杆菌菌株均是大肠杆菌菌株K12的衍生物。在遗传、生化代谢等方面这些突变菌株各有不同程度的差异,对于做不同自菌株基因很适合。

Ecoli-Complenterico.png

大肠杆菌的分类
1:HB101菌株
特点:该菌株具有稳定的遗传性能,可以方便的使用,对于各种基因重组实验均适宜。
基因型:SCS110或thi-1M110,leuB6,mtl-1,xyl-5,rpsL20,galK2,lacY1,proA2,ara-14,recA13,hsdS20(rB-mB-),supE44。

2:TOP10菌株
特点:该菌株对于高效的DNA克隆和质粒扩增很适用,能够使得高拷贝质粒的稳定遗传得到确保。
基因型:nupG,(Strr)endA1,galK,rps,galU,araΔ139Δ(ara-leu)7697,recA1,△lacⅩ74,lacZΔM15,φ80,F-,mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)。

3:JM109菌株
特点:该菌株在用M13phage载体进行转染或使用pUC系列质粒载体进行DNA转化时,因为JM09编码的LacZΔM15和载体DNA产生的LacZa多肽进行α-互补,因而使得β-半乳糖苷酶活性显示出来,因此重组体菌株很容易被鉴别出来。
基因型:Δ(lac-proAB)/F’,relA1,supE44,hsdR17,thi-1,gyrA96,endA1,recA1。

4:BL21(DE3)pLysS菌株
特点:该菌株由于含有质粒pLysS,所以具有氯霉素抗性。PLysS包含表达T7溶菌酶的基因,可以使目的基因的背景表达水平降低却不对目的蛋白的表达有所干扰。该菌株对于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达很适合。
基因型:dcm(DE3,pLysS,Camr),gal,ompThsdS(rBB-mB-),F-。

5:BL21(DE3)菌株
特点:该菌株被用来对克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因高效表达。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区,λ噬菌体DE3区在BL21的染色体上整合。该菌株对于非毒性蛋白的表达很适合。
基因型:dcm(DE3),gal,hsdS(rBB-mB-),ompT,F-。

6:DH5a菌株
DH5a菌株常被用于质粒克隆。E.coliDH5a在使用pUC系列质粒载体转化时,可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。可以起到对菌株进行蓝白斑筛选鉴别重组的作用。
基因型:relA1,gyrA96,thi-1,λ-,supE44,phoA,hsdR17(rk-,mk+),endA1,recA1,deoRΔ(lacZYA-argF)U169,,φ80dlacZΔM15,F-。

大肠杆菌转化操作步骤

我们都知道大肠杆菌转化可以:
(1)将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制,增殖和表达,以获得目的基因;
(2)验证大肠杆菌感受态细胞效果;
(3)用于分子生物学其他研究。

E-coil-Salmonella-WP.jpg

大肠杆菌转化操作步骤
(1)事先将恒温水浴的温度调到42℃。
(2)从-70℃ 超低温冰柜中取出一管(100μl)感受态菌,立即用手指加温融化后插入冰上,冰浴5~10min。
(3) 加入5μl连接好的质粒混合液(DNA含量不超过100ng),轻轻震荡后放置冰上20min。
(4) 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2min进行热休克,然后迅速放回冰中,静置3~5min。
(5) 在超净工作台中向上述各管中分别加入500μl LB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀,然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h.细胞
(6) 在超净工作台中取上述转化混合液100~300μl,分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀(注意:玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻,待其冷却后再涂)。
(7) 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话,滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal,8μl 20% IPTG,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
(8) 在涂好的培养皿上做上标记,先放置在37℃恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后,再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。
(9) 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇,擦干桌面,写实验报告。
(10)观察平板上长出的菌落克隆,以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑

 


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